摘要：探讨中国越野滑雪运动员运动能力与CNTF基因多态性的关联性，为越野滑雪运动员的基因选材提供前期探讨性的理论依据与基础数据。方法：采用PCR-RFLP方法测定30名越野滑雪运动员与30名普通大学生的基因的多态性。结果：对照组等位基因频率为A=10.17％，G=88.13％，基因型频率为A/A=0％，A/G=20.69％，G/G=79.31％，越野滑雪运动员等位基因频率为A=20％，G=80％，基因型频率为A/A=6.67％，A/G=26.67％，G/G=66.67％。经卡方检验不符合HardY-Weinberg遗传平衡定律，且CNTF基因型分布和等位基因与对照组的基因型频率和等位基因频率无统计学意义(P>0，05)结论：CNTF基因的多态性与中国黑龙江省越野滑运动员运动能力无相关性。
关键词：基因多态性：运动能力：选材
中图分类号：G804.23 文献标识码：A 文章编号：1008-2808(2012)04-0118-04
随着科学技术的高速发展，分子生物学尤其是基因选材的研究日趋深入。近年来，此方面已成为选材的研究热点，也取得了令人鼓舞的成果。研究表明机体的某些运动能力(力量、耐力、速度等)具有相当高的遗传度。睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophicfactor，CNTF)是体内具有多种生物学功能的细胞因子，能够促进运动、感觉等神经元的存活，防止神经损伤对副交感神经有营养作用，对感觉神经元和交感神经也有一定的作用。研究发现骨骼肌中存在着大量的CNTF的受体，它不仅对神经细胞起作用，而且对骨骼肌的生长及功能也起到营养作用。CNTF基因的多态性与运动能力有较大的关系，GA基因型携带者的肌肉力量与爆发力显著高于GG和AA基因型携带者，提示CNTF基因的多态性与人体肌肉力量有关联，但由于此方面研究较少，大多从综述的角度加以总结，缺乏大量的实验研究和结果，需深入系统地研究。优秀运动员选材是体育科研界一项重要的工作，不但可以帮助教练员尽早发现，挖掘具有特殊竞技能力的人才，而且可节省大量的人力、物力和财力。我国越野滑雪运动虽起步较晚，但已有向世界比赛牌冲击的潜力。越野滑雪运动作为体能主导类项目，运动员的力量和耐力素质对运动成绩起着决定性作用。研究力量相关基因CNTF的多态性与越野滑雪运动的关联必将为此项目的选材提供实验的数据。
1实验对象与方法
1.1实验对象
实验组：中国黑龙江越野滑雪队队员30名，运动等级一名国际健将，9名国家级健将、其余为国家一、二级运动员。训练年限平均5.75年。年龄17～24岁。对照组：选择哈尔滨体育学院运动人体科学专业的本科学生30名作为实验对象，年龄在18～22岁；未经任何专业训练。测试人员全部为北方汉族，测试时身体健康。
1.2实验内容
采用PCR-RFLP方法对越野滑雪运动员和普通大学生CNTF基因多态性的频率分布分析，CNTF基因A/G多态性的分布特征。
1.3实验仪器
PCR扩增仪(德国eppend 22331)；北京水平板电泳仪(DYYlll3)上海复日紫外与可见光分析装置、成像系统及其软件(FR-200)。
1.4CNTF基因A/G多态性测定过程
1.4.1取静脉血5ml，加入2％EDTA混合抗凝，由白细胞制备模板DNA，promega公司全血总DNA提取专用试剂盒提取。
1.4.2引物的选择、合成、扩增及质控
根据Takahashi等报道的碱基序列，参考Thome等报道的引物序列由华大公司进行合成，常规处理保存。
引物序列：S5-CTG GAG ACC ACT CCCATCCTTTCT-3
AS5-CAG GTT GAT GTT CTT GTT CAT GCCC-3
1.4.3扩增体系：25μL反应体系：10×Taq buffer5μL dNTP 0.5μL，上下游引物各2μL(10pmol)，Taq酶0.125U1，模板DNA 2L，以灭菌双蒸水补足体积。反应条件：预变性95℃5 min，变性94℃ 30s，退火60℃20s，延伸72℃10s，35个循环，终末延伸72℃7min。扩增产物以3％琼脂糖凝胶电泳40min。(以上试剂由promega公司提供)
1.4.4酶切
酶切体系：20μl,HaeⅢ限制性内切酶0.5μl，BSA0.2μl，扩增产物17.3μl，buffer 2μl。反应条件：37℃水浴，2.5h。(以上试剂由promega公司提供)
1.4.5电泳
酶切产物在含有0.5μg/ml EB的3％的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker DL2,000为片段长度标志，电压100V，电泳30min。凝胶成相仪监测结果并留取照片(见图1)。
1.5数据处理
数据由SPSSll.5 for Windows软件包处理。等位基因和基因型频率分布经基因平衡定律(Hardy-Weinberg，H-W)检验，以确认所选人群具有群体代表性。等位基因和基因型频率采用基因计数法计算。组间等位基因和基因型频率分布采用卡方检验。
2实验结果
2.1CNTF基因的实验结果
睫状神经因了(CNTF)因它能促进鸡胚睫状神经节神经元存活而得名，具有200个氨基酸的残基，基因定位llq12，由一个内含子和两个外显子组成，HaeⅢ多态位点位于内含子和第二个外显子之间，扩增后的长度为134bp，酶切后含酶切位点的等位基因为94bp、40bp,定义为G，不含酶切位点为134bp定义为A，出现了三种基因型G/G、G/A、A/A。
Lanel为Marker(100 200 300 400 500 600 700 800900 1000bp)；
lane2、3为杂合子G/A电泳带；lane4、5、6为纯合子AA电泳带； lane 7、8、9为纯合G/G电泳带；Lane10、11为PCR产物。
lanel为Marker(100 200 300 400 500 600 700 800900 1000bp)；
lane2、3为杂合子G/A电泳带；lane4、5、6为纯合子AA电泳带；
lane了、8、9为纯合G/G电泳带；Lanel0、11为PCR产物。
2.2CNTF基因A/G多态频率分布的Hardy-Weinberg平衡检验
运动员组和对照组人群的分布卡方值为0.833
3.1实验对象的选择
选用遗传学理论与方法进行研究时，各种因素对其结果的影响远远高于其它实验。而实验对象选择的正确与否直接决定着结果的可信度和代表性。本研究在实验对象的选材上尽量避免可预见性的因素干扰，以求研究结果具有一定的代表性。
3.1.1样本量的选择
群体遗传学是观察人群中遗传结构及其变化规律的，其变化主要表现在基因型频率和等位基因频率的状态。其中，影响这种状态的最主要的因素之一是群体的大小。最理想的样本量在400～500人以上。当前国内外如大多数的研究样本量集中于250人以下。远未达到理想的样本量。如席翼研究人数最多的是对照组216人实验组100人。英国H.Montgomery实验室是当前此研究领域中杰出的实验室之一，他们所选择的研究对象也不超过80人，最少时是33人，样本量的选择也偏小。本实验选取了黑龙江省越野滑雪队，由于我国冰雪运动起步较晚，使得我国的越野滑雪运动与世界一流水平存在着一定的差距。在政府和社会各方面力量的支持下，我省的越野滑雪项目有了长足的进步。但由于越野雪运动受地域、经济、人们喜爱程度等诸多因素的影响，导致我省越野滑雪项目参加的人数少，有优异成绩的专业运动员更少。本实验所选择的30名运动员，其中黑龙江省一队的15名运动员中国际健将级运动员1名、国家健将级的9名、国家一级运动员2名、二级运动员3名，其它运动员全部为省级运动员达到了优秀运动员的标准。可以说此30名运动员代表了我国越野滑雪运动员的水平。对照组人数的选择考虑在统计时人员的齐性相对应地选择了北方汉族30名。CNTF的研究多集中于神经疾病和精神类疾病的治疗方面，此基因的多态性与力量关联的研究实验还处于初步阶段，可用于同一项群的横向比较和不同人群的纵向比较的数据寥寥无几。由于所选择的人数具有局限性，可能会影响到统计学的结果。本研究对于黑龙江省越野运动员特定的范围进行研究，旨在为我国冰雪运动员的科学选材提供数据。
3.1.2运动项目的选择
国内外在基因选材的研究中对运动项目的选择多集中于长跑、登山、游泳等项目。对于冬季项目的基因选材的研究未见系统的报道。只有Rankeinen选择了包括越野滑雪、冬季两项和中长跑等耐力运动员192名与189名健康者ACEI/D基因型比较，结果也无差别。但此实验的研究对象为高加索人，因为种族对基因选材的影响较大，本研究选取中国汉族越野滑雪运动员作为研究对象填补了基因选材的国际空白。
3.2CNTF基因多态性与运动能力
CNTF是约200个氨基酸组成的多肽激素。由成熟个体外周神经中的施旺细胞、星形细胞中的一些亚细胞群体和中枢神经系统分泌的胞液分子，而非由靶组织分泌。CNTF最初被认为是睫状神经节副交感神经元培养时的营养因子，并由此命名。Komi等对31对两性双生子的股外侧肌进行活检研究，结果发现：I型朋纤锥的分布比例是基因型依赖性的。Simonean的研究提示：无氧耐力和高强度周期性训练引起相关最大酶活性变化由基因型决定。Maes等对10岁的双生子及他们的父母进行肌肉力量的研究得出：肌静力、爆发力和功能性肌肉力量均表现为遗传传递诱导或主要由遗传控制。王珮等研究表明：我国优秀女子力量运动员的CNTF基因多态性与普通人相比没有显著陸差异。本实验结果显示，越野滑雪运动员属于特殊人群，无群体代表性，且基因型频率与等位基因频率无差异。对于所选择的同一试验对象，共测定两种运动相关的基因多态性，分别是ACE基因的多态性和CNTF基因的多态性。但结果截然不同，ACE基因既有群体代表性且基因型频率和等位基因频率与对照都有差异。分析CNTF基因无群体代表性的可能性，其一是所选取的样本人数少，但ACE也是同样样本却有群体代表性，说明此可能不大。其二，CNTF与对照组就是无任何差异，无论从代表性还是基因型和等位基因，此结果与Rankeinen结论相一致。提示中国越野滑雪运动员力量素质与CNTF的多态性无关。
4结论
中国越野滑雪运动员CNTF可能因为所选取的样本数量有限而得出无代表性的结论。但也不排除此项目所选取的运动员CNTF基因多态性与力量素质无关的可能性。今后可继续加大样本量为我国开展冰雪运动员基因选材提供前期的准备和实验数据。