中文摘要摘 要生物材料的生物相容性评价对生物材料的研究具有重要的指导意义。为了全 面分析评价生物材料的生物相容性，近年来许多研究都集中在生物材料与机体相 互作用的机理研究上，其中尤以在分子水平探讨生物材料与机体相互作用的机理 是国内外研究的一大热点。本研究利用先进的基因表达系列分析(SAGE)技术， 从转录组水平全面分析生物材料与机体相互作用的机制，建立一种全新的评价生 物材料生物相容性的方法。聚乳酸是一种具有优良的生物相容性和生物降解性的高分子医用生物材料。
为了克服聚乳酸的临床使用缺点和提高其亲水性及细胞亲和性，本研究采用马来 酸酐(MAH)对聚(D，L．乳酸)(PDLLA)进行化学改性制备一种新型的马来酸 酐改性聚(D，L 一乳酸)(MPLA)材料，考察了 MPLA 和 PDLLA 材料亲／疏水性和 材料表面形貌，并对 MPLA 和 PDLLA 材料的细胞生物相容性进行评价。同时， 采用LongSAGE 方法，构建了在 MPLA 和 PDLLA 材料上 MC3T3．E1 成骨细胞的 LongSAGE文库，并对 MPLA 和 PDLLA 材料调控的差异表达的基因进行 GO 分析 和 KEGG 通路分析，从分子水平探索 MPLA 材料与细胞相互作用的分子机制，评 价其分子生物相容性。主要研究内容和结论如下：(1)采用静态水接触角和吸水率方法检测 MPLA 和 PDLLA 材料亲／疏水性，同时采用原子力显微镜对 MPLA 和 PDLLA 材料表面形貌进行观察。①亲／疏水性研究结果表明，MPLA 材料的水接触角小于 PDLLA 材料的水接 触角，而 MPLA 材料的吸水率大于 PDLLA 材料的吸水率，这说明 MPLA 材料的 亲水性优于 PDLLA 材料。②表面形貌研究结果表明，PDLLA 和 MPLA 材料表面形貌基本相似。(2)从细胞形态学、细胞粘附和铺展、细胞骨架、细胞增殖、以及细胞分化和矿化等几个方面，对 PDLLA 和 MPLA 材料进行了细胞生物相容性的评价。①细胞形态学实验的结果表明，MPLA 材料有利于成骨细胞早期的附着和粘附，而并不影响该细胞正常的形态；②细胞粘附和铺展实验的结果表明，MPLA 材料对细胞的粘附较强，细胞粘 附后铺展的面积也较大；PDLLA 材料对细胞的粘附较弱，细胞的铺展面积也相应 较小；可见 MPLA 材料对细胞粘附和铺展有促进作用；③细胞增殖和细胞周期实验的结果表明，MPLA 材料上成骨细胞具有较高的 增殖活力，在接种初期增殖速率较快，可见 MPLA 材料对成骨细胞的增殖有促进作用；
重庆大学博士学位论文④细胞分化和矿化实验的结果表明，MPLA 材料上成骨细胞的 ALP 活性以及分泌的无机钙含量都显著性高于 PDLLA 组和对照组，可见 MPLA 材料对成骨细胞的分化和矿化也有促进作用。这些结果提示，MPLA 材料比 PDLLA 材料具有更 好的细胞生物相容性。(3)采用 LongSAGE 技术，构建了在 MPLA 和 PDLLA 材料上 MC3T3．E1 成骨 细胞的 LongSAGE 文库，为生物材料的生物相容性评价提供了一个新方法。(4)采用 SAGE2000 软件和 SAGEmap 数据库，对 MPLA 和 PDLLA 材料作用 的 MC3T3．E1 成骨细胞的 LongSAGE 文库进行分析研究。①建立了 PDLLA 和 MPLA 两个 LongSAGE 文库，共获得 38484 个标签。
PDLLA 文库标签为 19438 个，特异性标签为 6964 种。而 MPLA 文库标签为19046 个，特异性标签 7205 种。结果显示，PDLLA 和 MPLA 两个文库中标签匹配情况 和丰度分布情况都基本相同，表明两者的标签数据具有可靠性和可比较性。②相对于 PDLLA 文库，MPLA 文库中共有 202 个显著性差异表达的标签，其中上调表达的标签有 92 个，而下调表达的标签有 110 个。结果显示，MPLA 材料 都能有效地调节成骨细胞基因的表达。③实时定量 PCR 检测结果显示，选择的 8 个差异表达的基因(Aktlsl、Calml、 Cdknla、Cfll、Fnl、Hdacl、Hdac5 和 Mt2)的差异表达的情况与LongSAGE 实 验结果基本一致，验证了 LongSAGE 实验结果的可靠性。这些结果提示，与 PDLLA 相比，MPLA 材料中引入．COOH 活性基团，其化学结构的变化能调控成骨细胞基因的差异表达。
(5)采用 GoSurfer 软件和 KEGG数据库，对 PDLLA 和 MPLA 材料作用的MC3T3．E1 成骨细胞的 LongSAGE 文库中筛选出的差异表达基因进行 GO 分析和通路分析研究，以及对其分子机制进行探讨。①生物学过程的 GO 分析结果显示，MPLA 材料调控的差异表达基因主要富 集的功能分类为细胞生理过程、细胞通讯、细胞过程的调控、细胞分化、代谢、 定位、应激反应及形态学等；②分子功能的 GO 分析结果显示，MPLA 材料调控的差异表达基因主要富集的功能分类为蛋白质结合、核酸结合、离子结合、核苷酸结合、转运子活性、离子运输活性、水解酶活性、氧化还原酶活性及转移酶活性等；③细胞组分的 GO 分析结果显示，MPLA 材料调控的差异表达基因主要富集的功能分类为细胞内、膜、细胞内器官、核蛋白复合体、质子运输 ATP 酶复合体、质子运输 ATP 合成酶复合体以及转录因子复合体等；④MPLA 材料调控的上调基因主要参与调控了细胞增殖、细胞周期、细胞骨架的组成、细胞激活、骨形成以及骨重建等生物学途径；MPLA 材料调控的下调lI
中文摘要基因主要参与调控细胞死亡、负调控凋亡、染色质的修饰、细胞生理途径、代谢 途径、以及生物合成等生物学途径；⑤KEGG 通路分析结果表明，MPLA 材料调控的差异表达基因主要参与调 控了核糖体蛋白通路、氧化磷酸化通路、细胞周期通路、肌动蛋白细胞骨架通路、 蛋白酶体通路及溶酶体通路等。(6)MPLA 材料与成骨细胞相互作用的分子机制总结如下：①由于 MPLA 材料表面的亲水性的．COOH 基团，通过调控了细胞的肌动蛋白骨架调节通路及相关基因的表达，有利于细胞早期的粘附和铺展；②MPLA 材料作用后，通过调控核糖体通路，上调了核糖体蛋白基因的表达，促进核糖体蛋白的合成，同时增强细胞内 DNA 合成和细胞分裂，促进了细胞的生 长和增殖；③MPLA 材料作用后，通过调控氧化磷酸化通路，增加细胞的氧化磷酸化水平，增强细胞内的能量代谢；④MPLA 材料通过调控蛋白酶体通路和溶酶体通路，有利于细胞的 DNA 损 伤的自身修复和防御功能，同时调控细胞周期通路和 P21 基因表达，防止细胞过 度增殖和细胞凋亡；，⑤MPLA 材料作用后，抑制 Hdacl 和 Hdac5 基因的表达，增强了细胞的转录活性，促进碱性磷酸酶和无机钙的合成，促进成骨细胞的分化。
上述结果提示，MPLA 材料比 PDLLA 材料具有更好的生物相容性。关键词：聚(D，L 哥 L 酸)，生物相容性，基因表达序列分析，基因表达，表面改性111
英文摘要ABSTRACTBiocompatibilityevaluation of biomatcrials isvery importantin the research ofbiomaterials．For comprehensive analysis of biocompatibility evaluation of biomaterials，recent researches have been focused on the basis of cell—biomaterialinteraction,particularly the molecular basis of cell-biomaterial interaction．In this work，advancedserialanalysisofgene expression(SAGE)technologywas used toinvestigatethemechanism ofcell—biomaterial interaction at the transcriptlevel，thus establishing thenew method for biocompatibility evaluation of biomaterials．Polylacticacid isone kind of biomedicalpolymermaterials 、 析 tllgoodbiocompatibilityandbiodegradability．Inorder to overcome theshortcomingsofpolylacticacid in the clinical use andimproveitshydrophilicityand cellularaffinity,maleic anhydride(MAH)Was used to make chemical modification of poly(D，L—lacticacid)(PDLLA)for obtaininga newtypeof maleicanhydridemodifiedpoly(D，L-lacticacid)(MPLA)material．Thesurfacewettabilityand surfacetopographyof PDLLA andMPLA materials wereinvestigated．Thereafter,LongSAGE technology was used toconstruct the LongSAGE libraries of MC3T3．E1 cells cultured 011 PDLLA and MPLAmaterials，meanwhileGeneOntology(GO)and Kyoto Encyclopediaof Genes andGenomes(KECO)pathwaywere used toanalyzethefunction ofdifferentiallyexpressed genesregulated by PDLLA and MPLAmaterials，thus exploringthemolecular mechanism of cell-biomaterial interaction and evaluation ofbiocompatibility．The main works and conclusions are included as follows：(1)Thepropertiesof PDLLA and MPLA material films wereinvestigated，including surface wettability and surface topography．The surface wettability evaluationWas based on static water contactangleand wateradsorption ratio，whileAtomic ForceMicroscope(AFM)Was used to estimate the surface topography．①m surface wettability experiment results showed that water contact angle ofMPLA material was less than that of PDLLA，while the wateradsorption ration ofMPLA materialwas more than that of PDLLA．The results revealed thatthehydrophilicityof MPLA material Was superior to that of PDLLA．②Thesurfacetopography experimentshowed that the surfacetopographyofMPLA material Was similar to that of PDLLA．(2)The cytocompatibility of PDLLA and MPLA materials with mouse osteoblastsV
重庆大学博士学位论文(MC3T3 一 E1)wasestimated from theaspectsof cellmorphology,adhesionandspreading，proliferation，differentiation,mineralizationand SOon．①11lc cell morphology experiment results showed that MPLA materialhelpedthe early stage adhesion of osteoblasts，and did not affect the normal cell morphology,compared 、 析 thPDLLA．②m cell adhesion and spreading experiment results showed that MPLAmaterial increased cell adhesion and the cell spreading area compared witll PDLLA，indicating that MPLA material promoted cell adhesionand spreading．③The cell proliferation and cell cycle experiment resultsshowed that MPLAmaterial increased cell proliferation activity,especially at earlystage of cell seedingcompared with PDLLA，indicatingthat MPLA materialpromoted cell proliferation．④The cell differentiation and mineralization experiment results showed that theALP activity and inorganic calcium content of osteoblasts cultured on MPLA materialWassignificantlymore than those ofPDLLA，indicatingthat MPLA materialpromotedcell differentiation and mineralization．These results abovesuggested that MPLAmaterial had better cytocompatibility compared with PDLLA．(3)The LongSAGE technology Was used to construct the LongSAGE libraries ofMC3T3 一 E1 cells cultured on PDLLA and MPLA materials ， supportinga novelmethod for biocompatibility evaluation of biomaterials．(4)The SAGE2000 SOftware and SAGEmap database wereappliedtoanalyzingtheLongSAGElibraries of MC3T3 一 E1 cells cultured on PDLLA and MPLAmaterials．①Two LongSAGE libraries of PDLLA and MPLA were constructed to obtain38484tags．Therewere 1 9，438tags representing 6，946 unique tagsin the PDLLALongSAGE library,and1 9，046 tags representing 7205unique tagsin the MPLALongSAGE library．Theseresults revealed that thetag matching andabundancedistribution of PDLLA and PDLLA libraries were similar,suggesting that those data ofbothlibraries had reliability and comp 耐 bili 够②Compared w 曲 PDLLA，202 LongSAGE tagswere founddifferentiallyexpressedin MPLAlibrary．Among these tags，92 tagswere foundup·regulated，while1 1 0tagswere founddown-regulatedin MPLA library．These results revealed thatMPLA material couldeffectivelymodulate thegene expressionof osteoblasts，compared 、 析 tllPDLLA．③Real．time PCR experiment results showed that the expression levels of selectedeight differentially expressed genes(Aktlsl，Calml，Cdknla,Cfll，Fnl，Hdael，Hdac5VI
英文摘要andMt2)were generallyin accordance with theLongSAGE data,validatingthereliability of LongSAGE experiment results．These results above suggested that the change of chemical structure of MPLAmaterial could modulate the differential expression of osteoblasts，due to introduction of·COOH functiongroup compared 、 析 thPDLLA．(5)The GoSurfer software and KEGG database wereappliedto GO and KEGGpathway analysisof screeneddifferentially expressed genesfrom theLongSAGElibraries of MC3T3 一 E1 cells cultured on PDLLA and MPLAmaterials，probingthe molecular mechanism of cell．biomaterial interaction．①The biological process of GO analysis results showed that the main enrichmentof functional classification of differentially expressed gen...