武亚南，石玉祥，张永英，刘冠慧，宋伟光，钟翠红，王永霞
(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056038;2.晨光生物科技有限公司，邯郸 056038)
由于自身生理特点及现代集约化养殖模式，肉鸡极易发生热应激。热应激可引发肉鸡心肌细胞氧化损伤,影响肉鸡心脏的正常功能，降低肉鸡生产性能，增加肉鸡猝死综合征和肉鸡腹水综合征的发病率，给肉鸡养殖业带来巨大的经济损失[1-2]。肉鸡在高温环境中，血液循环加快，心脏负担加重，心肌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)等代谢酶受高温影响活性下降，引起氧化系统和抗氧化系统失衡[3]。过量的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，导致脂质氧化终产物丙二醛(MDA)大量积累，损伤线粒体膜和细胞膜[4]。此外，在热应激状态下，心肌细胞线粒体的氧化磷酸化效率逐渐降低，钙-腺苷三磷酸酶活性和钙含量也降低，线粒体膜通透性转换改变，进而导致细胞色素C释放到细胞质,激活凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3),引起心肌细胞损伤[5]。血红素氧合酶-1(HO-1)过表达可通过稳定线粒体膜和减少氧化产物生成缓解H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤[6]。陈洪博等[7]研究表明，热应激引起肉鸡心肌细胞MDA含量增加，细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性增强,SOD活性显著降低，心肌细胞产生氧化损伤。
核因子红系2相关因子2(Nrf2)信号通路在细胞抗氧化应激反应中发挥中枢调控作用[8],是治疗心肌疾病、心功能障碍及抗心肌细胞氧化损伤的重要药物靶点[9]。SIRT1(sirtuins家族中负责调控细胞蛋白质去乙酰化的酶)通过调控Nrf2蛋白去乙酰化激活Nrf2信号通路，促进通路下游HO-1和NAD(P)H∶醌氧化还原酶1(NQO1)的表达，提高心肌细胞的抗氧化能力，减少LDH的释放，减轻心肌细胞缺氧/复氧所造成的氧化损伤[10]。近年来，Nrf2信号通路调控热应激诱导畜禽氧化损伤机制的研究也越来越多[11-12]。Zhang等[13]研究发现,姜黄素可通过激活Nrf2信号通路上调热应激肉鸡肝脏中谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCLC)和HO-1基因的转录水平增强肉鸡抵抗热应激损伤的能力。王换换等[14]研究表明，高温可激活奶牛肝脏Nrf2信号通路，上调HO-1、GCLC和NQO1基因表达，从而颉颃热应激诱导的奶牛肝脏氧化损伤。但鲜见有关激活Nrf2信号通路是否能够缓解热应激诱导的肉鸡心肌细胞氧化损伤的报道。本试验通过构建肉鸡心肌细胞热应激氧化损伤模型，用Nrf2特异性激活剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)预活化Nrf2，探索激活Nrf2信号通路对热应激肉鸡心肌细胞氧化损伤的缓解作用，旨在为预防家禽热应激提供新思路和有效分子靶点。
1.1 主要试剂
DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；
Ⅱ型胶原酶购自上海源叶有限公司；
5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)、双抗(青、链霉素)、TBHQ、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SOD、LDH、MDA检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；
Nrf2和HO-1多克隆抗体购自Proteintech Group,Inc.；
辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自Abcam公司；
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒、HiScript Ⅲ型RNA反转录试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.2 原代心肌细胞的制备
参照秦士贞[15]方法制备肉鸡原代心肌细胞。无菌取出10日龄肉鸡鸡胚的心脏，冷D-PBS洗3～5次，眼科剪剪碎心脏组织后，用冷D-PBS洗涤至透明。弃上清液，加约5倍体积于心脏组织的0.12%胶原酶Ⅱ，于37 ℃水浴锅中消化8 min，第一次消化液弃之不用。再次加入消化液在同等条件下继续消化8 min，将消化液转移至另一无菌试管中并加入等量培养基终止消化。按照前述方法重复消化5～6次直至没有明显的组织块。用500目细胞筛网过滤2次，去除组织块。收集所有消化液，800 r/min离心10 min，弃上清液，用培养基重悬。在37 ℃、5%CO2培养箱中进行2次差速贴壁培养(差速贴壁时间为1.5 h)，去除成纤维细胞。用台盼蓝染色法检测心肌细胞浓度。用含有5-Brdu的细胞培养基将心肌细胞稀释至2.5×106/mL和2.5×104/mL(5-Brdu的终浓度是0.1 mmol/L，其作用是抑制成纤维细胞的生长)，分别接种于6孔板和96孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后换为不含5-Brdu的正常培养液，24 h后更换细胞培养液备用。
1.3 模型构建
以43 ℃作为热应激温度[16]，将接种于96孔板的心肌细胞随机分为5组，分别培养0、2、4、6、8 h，采用MTT法检测肉鸡心肌细胞相对活力，确定构建热应激模型的时间。
1.4 试验分组与处理
另取生长于96孔板和6孔板中的原代心肌细胞分别随机分成3组：对照组，心肌细胞正常培养不做处理；
Nrf2激活剂+HS组(TBHQ+HS组)，弃去96孔板和6孔板中的旧培养基，用PBS清洗3次，加入50 μmol/L TBHQ(以0.075%DMSO为溶剂，已验证DMSO<0.01%时对心肌细胞活力无影响[17])在正常培养条件下预处理12 h，然后同热应激组(HS)组同时转移至43 ℃培养箱孵育2 h。每组6个重复。96孔板用于心肌细胞相对活力测定，6孔板用于其余指标的测定。
1.5 测定指标
1.5.1 原代心肌细胞形态学观察 在倒置显微镜下观察比较各组心肌细胞形态。
1.5.2 原代心肌细胞相对活力 应用MTT法检测各组原代心肌细胞相对活力，于96孔板中小心吸取上清，加入90 μL新鲜培养基，再加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h。吸弃上清，每孔加入110 μL DMSO，低速震荡10 min，使结晶充分溶解。用Thermo Scientific Multiskan Spectrum全波长酶标仪测490 nm处各孔的吸光值，计算公式如下：
细胞相对活力=(样品D490 nm-本底D490 nm)/(对照D490 nm-本底D490 nm)
1.5.3 原代心肌细胞氧化应激和氧化损伤指标 用移液枪将孔中的培养液转至1.5 mL无菌离心管中，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，吸取培养液上清转移至另一离心管中，用于测定细胞培养液上清中LDH活性。PBS清洗3遍细胞，用细胞刮板刮取孔内心肌细胞，再加入200 μL PBS，用超声波破碎心肌细胞，用于测定心肌细胞SOD活性和MDA含量。
1.5.4 Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1 mRNA表达量 吸弃6孔板中的培养液，在孔内加入Trizol提取细胞总RNA，通过核酸测定仪测定RNA浓度及纯度，提取的RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存备用。应用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR检测。
表1 引物信息
1.5.5 Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达水平 弃去6孔板中的培养液,加入裂解液在冰上裂解细胞，提取蛋白，以BCA法测定蛋白浓度。细胞样品在100 ℃水浴中加热4 min，以充分变性蛋白。以GAPDH作为内参蛋白，Western Blotting检测Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达水平：每孔上样10 μg总蛋白，在SDS-PAGE中进行电泳分离，然后电转至PVDF膜上；
用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h后，加入一抗(Nrf2/HO-1多克隆抗体，1∶500)，室温孵育1 h后，4 ℃过夜；
用TBST洗膜后，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶10 000)室温孵育1 h；
TBST洗膜后，用ECL发光液检测目标蛋白条带的光密度，采用ImageJ图像分析软件对样品中目标蛋白进行定量。
1.6 数据统计分析
用SPSS 20.0统计软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析考查不同热应激时间对肉鸡心肌细胞活力的影响及TBHQ对热应激肉鸡原代心肌细胞活力、抗氧化能力及Nrf2信号通路相关抗氧化基因和蛋白表达的影响，差异显著时进行LSD多重比较。结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2.1 热应激作用时间对肉鸡原代心肌细胞相对活力的影响
由图1可知，高温极显著抑制肉鸡原代心肌细胞活力(P<0.01)，热应激2 h可作为构建热应激模型的最佳时间点。
**，与0 h相比差异极显著(P<0.01)
2.2 TBHQ预处理对热应激肉鸡原代心肌细胞形态、细胞活力和氧化损伤的影响
2.2.1 细胞形态 由图2可知，对照组心肌细胞呈正常梭形(图2A)，细胞密度较大；
HS组心肌细胞体积变大且出现空泡网状结构(图2C)，贴壁细胞数量减少；
TBHQ+HS组心肌细胞空泡网状结构明显少于热应激组，大部分细胞形态呈正常梭形(图2B)。
①A，对照组；
B，TBHQ+HS组；
C，HS组。②a1、a2、b1，正常梭形的心肌细胞；
c1、c2、b2，有空泡网状结构的心肌细胞
2.2.2 原代心肌细胞相对活力 由图3可知，与对照组相比，HS组心肌细胞相对活力极显著下降(P<0.01)；
与HS组相比，TBHQ+HS组心肌细胞相对活力显著升高(P<0.05)。
与对照组相比，*，差异显著(P<0.05)；
**，差异极显著(P<0.01)。与HS组相比，#，差异显著(P<0.05)；
##，差异极显著(P<0.01)。无标记，差异不显著(P>0.05)。下同
2.2.3 原代心肌细胞SOD活性、MDA含量和细胞培养液中LDH活性 由图4可知，与对照组相比，HS组心肌细胞SOD活性极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著升高(P<0.01)，细胞培养液中LDH活性极显著上升(P<0.01)；
与HS组比较，TBHQ+HS组心肌细胞SOD活性极显著升高(P<0.01)，MDA含量显著下降(P<0.05)，细胞培养液中LDH活性极显著下降(P<0.01)。
图4 各组肉鸡原代心肌细胞SOD活性、MDA含量和细胞培养液中LDH活性
2.3 TBHQ预处理对热应激肉鸡原代心肌细胞Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1基因表达水平的影响
由表2可知，与对照组相比，HS组肉鸡原代心肌细胞中Nrf2和HO-1 mRNA表达量显著增加(P<0.05)；
与HS组比较，TBHQ+HS组肉鸡原代心肌细胞中Nrf2 mRNA(P<0.05)和HO-1 mRNA的表达量极显著增加(P<0.01)，而且Nrf2通路下游GCLC和NQO1 mRNA的表达量显著增加(P<0.05)。
表2 各组心肌细胞Nrf2、HO-1、GCLC和NQO1 mRNA表达量
2.4 TBHQ预处理对热应激肉鸡原代心肌细胞Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达量的影响
由图5可知，与对照组相比，HS组心肌细胞Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达量无显著差异(P>0.05)；
与HS组比较，TBHQ+HS组心肌细胞Nrf2总蛋白表达量极显著升高(P<0.01)，HO-1蛋白表达量显著升高(P<0.05)。
图5 各组心肌细胞Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达量
肉鸡的正常体温为39～40 ℃，但本研究所用原代心肌细胞取自10日龄肉鸡鸡胚，该日龄鸡胚的最适孵化温度为37～38 ℃，而且Xu等[18]研究表明，肉鸡心肌细胞40 ℃热应激1 h即可在电镜下观察到自噬体，因此40 ℃不适合肉鸡原代心肌细胞正常生长，因此将37 ℃作为肉鸡原代心肌细胞生长的最适温度[19]。
持续高温可诱导肉鸡心肌细胞产生氧化应激，显著降低心脏的细胞活力[20]。为确认Nrf2通路预活化对热应激肉鸡心肌细胞活力的作用，在细胞热应激之前加入TBHQ进行预处理。结果显示，相比于热应激组，TBHQ预处理可显著提高热应激心肌细胞的活力。心肌细胞在持续热应激作用下会发生严重的肿胀、变性[21]。本研究通过对心肌细胞形态学观察发现，热应激不仅可导致肉鸡原代心肌细胞肿胀，还会出现大量空泡网状结构，而TBHQ预处理可显著减少热应激心肌细胞中空泡网状结构。
MDA是氧自由基引发脂质过氧化反应的终产物之一,可在一定程度上反映氧自由基对机体的脂质过氧化损伤程度[22]。SOD为机体内抗氧化酶，能够有效清除体内的氧自由基，减轻氧自由基对心肌细胞膜的损伤[23]。LDH是心肌细胞损伤的标志酶，是糖酵解途径中重要的氧化还原酶，当心肌细胞遭受氧化损伤后，细胞膜通透性改变，LDH从细胞内释放到细胞外，导致细胞外液中LDH活性显著增强[24]。本研究结果显示，与对照组相比，热应激组心肌细胞MDA含量显著增加，细胞外液LDH活性增加，SOD活性显著降低，证明肉鸡心肌细胞热应激氧化损伤模型构建成功[25]。与热应激模型组相比，TBHQ预处理能显著提高热应激心肌细胞SOD活性，减少MDA含量，减轻心肌细胞内LDH的外流，从而减轻热应激对心肌细胞的氧化损伤。刘辉等[17]研究表明，通过TBHQ激活Nrf2信号通路可以颉颃氯化钴诱发的化学性缺氧对H9c2心肌细胞的氧化应激损伤，提高心肌细胞的抗氧化应激能力。本研究与其结果基本一致，不同之处在于心肌细胞种属不同，氧化损伤的诱因不同。
Nrf2是一种核转录因子，负责调控动物抗氧化酶类的转录表达,属于CNC(Cap‘n’Collar)-bZIP转录因子家族。Keap1是一种富含半胱氨酸的蛋白质，被锚定于肌动蛋白细胞骨架。抗氧化反应元件(ARE)是一种介导HO-1、NQO1、GCLC等酶类的顺式转录调控元件。在正常情况下，Keap1与Nrf2形成异二聚体并促进泛素-蛋白酶对Nrf2的降解作用，因此细胞内游离Nrf2含量很低。在亲电试剂或应激原刺激下，Keap1蛋白的半胱氨酸残基被修饰而构象改变，Nrf2从Keap1释放并转移到细胞核与ARE结合并激活靶基因HO-1、GCLC、NQO1及Nrf2自身的转录，启动细胞自我保护机制[26-27]。HO-1蛋白即热休克蛋白32[28]，是Nrf2信号通路调控的下游抗氧化酶之一，可将血红素降解为胆绿素、一氧化碳(CO)和亚铁，随后胆绿素被进一步还原为胆红素，胆绿素与胆红素是机体内源性的强抗氧化剂，可抑制细胞脂质过氧化，清除氧自由基，直接发挥抗氧化应激的效应[29-30]。以上研究结果说明，靶向调控Nrf2蛋白及下游抗氧化酶HO-1也许能减轻热应激诱导的心肌细胞氧化损伤。
TBHQ是一种人工合成的酚型强抗氧化剂和Nrf2激活剂，可通过自身抗氧化性和诱导Nrf2通路下游抗氧化酶的合成来减轻氧自由基对机体造成的损伤。目前认为TBHQ的抗氧化作用主要通过以下两种途径实现:①TBHQ本身可在体内通过醌促或非醌促氧化反应形成半醌，再转化成醌，通过氧化还原循环来降低体内氧自由基的含量[31];②TBHQ是经典内源性抗氧化Keap1-Nrf2/ARE信号通路的特异性激活剂，其机制为TBHQ修饰Keap1的CYS 151半胱氨酸残基，改变Keap1-Nrf2二聚体的构象，使Nrf2免受Keap1介导的泛素-蛋白酶体降解，Nrf2在细胞质中富集，多余的Nrf2在核输入蛋白的引导下进入细胞核与ARE启动子结合，启动抗氧化基因和解毒酶基因及Nrf2自身的转录翻译[32]。TBHQ作为公认的Nrf2激活剂，通过激活Nrf2信号通路上调通路下游抗氧化酶HO-1等基因的表达缓解亚砷酸钠致胰岛β细胞氧化应激损伤[33]，还可激活人主动脉内皮细胞Nrf2/ARE信号通路，上调通路下游NQO1的表达，进而增加SOD的活性，降低MDA含量，缓解尿毒症患者主动脉内皮细胞功能障碍[34]，以及调控牛子宫内膜上皮细胞Nrf2和HO-1的蛋白表达，颉颃氧化应激[35]。以上研究结果均表明，TBHQ主要是通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。这提示TBHQ对热应激肉鸡原代心肌细胞的保护作用可能也是通过激活Nrf2信号通路进而上调下游抗氧化基因的转录和表达而实现的。本研究的实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示，与对照组相比，热应激可上调Nrf2和HO-1 mRNA表达水平，但Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达无显著增加，不足以颉颃热应激诱导的氧化损伤。与热应激组相比，用TBHQ预处理后再进行热应激，肉鸡心肌细胞GCLC、NQO1、Nrf2、HO-1 mRNA呈一致性诱导表达增多，且Nrf2总蛋白和HO-1蛋白表达显著上调，表明TBHQ预处理可增加热应激肉鸡原代心肌细胞中Nrf2的含量和活性，使处于热应激状态的肉鸡原代心肌细胞有足够的Nrf2蛋白进入细胞核内与抗氧化基因的ARE启动子结合，启动抗氧化相关蛋白的表达，颉颃热应激诱导的肉鸡心肌细胞氧化损伤，提示Nrf2可能是调节肉鸡心脏抗氧化损伤的关键蛋白靶点[36]。
综上所述，Nrf2激活剂TBHQ可通过激活肉鸡心肌细胞Nrf2/ARE信号通路使Nrf2蛋白表达增加，进而上调Nrf2信号通路下游抗氧化酶的转录活性及抗氧化HO-1蛋白表达，进一步增强肉鸡心肌细胞遭受热应激时的抗氧化能力，缓解热应激诱导的肉鸡心肌细胞氧化应激，颉颃心肌细胞氧化损伤。
本研究初步探索了活化Nrf2/ARE信号通路缓解热应激肉鸡心肌细胞氧化损伤的相关分子靶点，有利于更好地认识肉鸡心脏抗氧化损伤机制，为预防热应激致肉鸡心脏损伤提供了理论依据。但应认识到Nrf2的持续激活也可能会对机体造成不良后果，且信号通路并不是单独发挥作用，各信号通路之间会交叉串扰，例如Nrf2/ARE信号通路和NF-κB信号通路。综合考虑各信号通路对抗氧化机制的影响是未来畜禽热应激防控研究的方向。
在本试验条件下，热应激可激活肉鸡心肌细胞抗氧化损伤机制Nrf2/ARE信号通路，但不足以颉颃热应激诱导的氧化损伤。采用Nrf2激活剂TBHQ增加心肌细胞Nrf2总蛋白含量可以上调Nrf2/ARE信号通路下游抗氧化基因的转录及抗氧化蛋白的表达，显著降低氧化损伤指标，进一步提高肉鸡心肌抗氧化能力。因此，采取措施适当增加Nrf2蛋白的表达能起到保护肉鸡心脏、缓解热应激致肉鸡心脏氧化损伤的作用。本试验结果可为预防肉鸡热应激提供新的思路和有效分子靶点。
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