程磊，陈蔚涛，于晓丽
（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，农业农村部淡水水产生物技术与遗传育种重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150070；
2.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部珠江中下游渔业资源环境科学观测实验站，广东 广州 510380）
鲫（Carassius auratus）在中国分布广泛，具有重要的生态、经济和科学研究价值[1]。2019 年，中国鲫年养殖产量约270 万t，是最重要的淡水养殖对象之一[2]。鱼类线粒体DNA 具有结构紧凑保守、母系遗传、进化较快等特点，被广泛用作群体遗传学和系统地理学研究中的分子标记[3]。Takada 等[4]基于线粒体DNA 遗传标记揭示了鲫中存在两大谱系，一支分布于日本列岛，另一支分布于欧亚大陆除日本列岛以外的地区，这两大谱系内又可分为若干亚谱系。Gao 等[5]在此基础上增加了中国、越南等地的样本，进一步在大陆谱系内识别出两个新的亚谱系（C1 和C5）。上述工作比较全面地揭示了鲫的系统地理格局：日本谱系和欧亚大陆谱系最早分化；
大陆谱系内C1 分布于福建、越南等亚洲大陆南部；
C2分布自东北亚直至欧洲的辽阔地域；
C3 分布于台湾岛；
C4 主要分布于琉球群岛；
C5 主要分布于长江中下游；
C6 则在中国长城以南广泛分布[4,5]。此外，陆续有研究发现中亚和东北亚存在另一个独特的谱系（C7）[6-9]。
2018 年，Rylková 等[10]揭示越南鲫中有两个分化明显的谱系，其中一支对应于中国鲫，另一支则被称为“越南谱系”。该研究还指出越南谱系内部分为两个亚谱系：一支分布于越南北部，向北可以到达中国的珠江流域和福建省等华南地区；
另一支分布于越南的南部。此前，越南鱼类学家认为鲫属（Carassius）在越南分布有一个独特的物种C.argenteaphthalmus，该种以眼缘红色为最显著的特征。但是，Rylková 等[10]研究后认为，C.argenteaphthalmus和越南谱系并非对应关系，考虑到鲫的种内表型变异较大，该种是否真实有效尚存疑。
Gao 等[5]的研究中并未分析检测位于中国福建和越南之间的广东、广西等省区的鲫样本；
Rylková等[10]的研究虽然涉及到广西的鲫样本，但是并未与Gao 等采自福建的样本加以比较[5,6]。在前人工作的基础上，本文采集了广东阳春、潮州和广西博白等地鲫样本，使得总的样本覆盖了越南及中国的福建、广东、广西等地。本文基于线粒体细胞色素B 基因（Mitochondrial cytochrome b，Cyt b），初步揭示了华南地区和越南鲫的遗传分化，加深了对中国鲫谱系地理格局的认识，为鲫种质资源的保护与利用提供了数据和理论支撑。
1.1 样本采集和总DNA 提取
本研究用到的样本主要有三个来源：（1）作者从广东阳春（24 尾）、潮州（2 尾）及广西博白（10 尾）采集的样本，共计36 尾；
（2）Gao 等[5]采自福建、越南等地的样本共计77 尾；
（3）Rylková 等[10]采集的越南、广西等地鲫样本，共计33 尾。采集样本时，剪取小块的鱼鳍组织，以酒精固定保存。在实验室中，以蛋白酶K 消化、酚-氯仿抽提总DNA[11]，纯化后的DNA 溶于去离子水中，稀释至约50 ng/μL 备用[8]。
1.2 线粒体DNA 变异检测
线粒体Cyt b 基因扩增引物为L14724（5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′）和H15915（5′-CT CCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′）[12]。PCR 反应体系为30 μL，包含1×的Es-Taq MasterMix（康为世纪），正反向引物各0.3 μM，约50 ng DNA 模板。扩增程序为：94℃预变性2 min；
94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环；
最后72℃终延伸7 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测是否为单一、清晰的目的条带，阳性PCR 产物送生物公司进行纯化及测序。
1.3 序列处理及数据分析
测序结果使用Clustal W 程序[13]进行序列比对（alignment）。采用DnaSP V6[14]软件计算单倍型数（Number of haplotypes）、多态位点数（Number of polymorphic sites）、单倍型多样性（Haplotype diversity）和核苷酸多样性（Nucleotide diversity）等参数。用Mega 7.0 软件[15]计算序列的碱基组成、群体内和群体间的平均遗传距离；
以邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建单倍型进化树。使用Arlequin 3.5 软件[16]提供的分子方差分析（Analysis of Molecular Variance，AMOVA）检测变异来源，样本采用两种不同的分组：（1）按照样本的采集地，分为福建（FJ）、两广（LG）和越南（VN）三组；
（2）按照样本的谱系归属，分为C1A、C1B 和C1C 三组。
2.1 线粒体Cyt b 基因遗传多样性
本研究共获得146 尾鲫的线粒体Cyt b 基因部分序列，比对后得到的序列长747 bp，共检测到32种不同的单倍型（表1），变异位点70 个，其中包含37 个简约信息位点（parsimony informative sites），33个单变异位点（singleton variable sites）。观察到碱基置换（substitutions）71 次，其中转换（transitions）62次，颠换（transversions）9 次。平均碱基组成：C=28.25%、T=30.21%、A=27.39%、G=14.16% 。A+T 的含量（57.60%）高于G+C 的含量（42.41%），碱基组成存在偏倚。总的单倍型多样性为0.900±0.016，核苷酸多样性为（1.686±0.847）%（表2）。
表1 鲫线粒体细胞色素b 单倍型变异的位点及在各群体中的分布Tab.1 The variable sites and population distribution of Cyt b haplotypes in goldfish Carassius auratus
表2 基于Cyt b 基因序列各类群的遗传参数Tab.2 Genetic parameters of each group based on Cyt b gene sequences
2.2 单倍型系统发育关系
为明确各单倍型的系统发育关系，基于之前的研究结果[4,5,6-9]，以黑鲫（Carassius carassius）为外类群，将本研究鉴定的32 种单倍型加入后，基于Cyt b基因构建了鲫属的邻接树（Neighbor-joining，NJ）。树的拓扑结构和前人的研究结果基本一致，支持鲫可以分为日本谱系和亚洲大陆谱系两大支系。本研究鉴定的32 种Cyt b 单倍型均属于大陆谱系，但是分属于6 个不同的亚谱系（图1）。多数的单倍型属于Gao 等[5]所发现的C1 谱系，但本研究的结果支持C1 实际分为3 个不同的亚谱系：谱系C1A 包含了Gao 等[5]采集自福建及本文采自广东的部分样本；
谱系C1B 包含了Rylková 等[10]采自广西和越南中北部及本文采自广东的部分样本；
谱系C1C 则包含了Gao 等[5]和Rylková 等[10]分别采自越南中南部的样本。余下的少数样本（22/146）分属于大陆谱系内部三个已知的谱系（C2、C4 和C6）。
图1 鲫基于Cyt b 基因序列的系统发育邻接树Fig.1 Phylogenetic tree（Neighbor-joining）of goldfish Carassius auratus based on Cyt b sequences
2.3 群体遗传分化分析
依据采样地点信息将样本分成福建（FJ）、两广（LG）、越南（VN）三个群体进行分子方差分析（AMOVA）分析。结果显示：三地的鲫有显著的遗传分化（Fst=0.444，P＜0.01），群体内和群体间均有丰富的遗传变异（表3）。两两群体间的Fst 为0.304～0.494间，各群体间均存在显著的遗传分化（P＜0.01），群体内和群体间遗传距离也较大（表4）。按照样本的谱系归属分成C1A、C1B、C1C 三组进行AMOVA 分析。结果显示三个谱系间有着更为显著的遗传分化（Fst=0.885，P＜0.01），谱系内遗传变异明显小于谱系间，表明大部分遗传变异存在于谱系之间（表3）。
表3 基于线粒体Cyt b 基因序列的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance（AMOVA）based on Cyt b haplotypes
表4 基于线粒体Cyt b 基因单倍型群体间的遗传分化系数Fst（对角线下方）、群体间的遗传距离（对角线上方）及群体内遗传距离（对角线上）Tab.4 Population pairwise Fst（below diagonal，P＜0.01）,genetic distances among populations（above diagonal）and genetic distances within populations（on diagonal）based on Cyt b gene sequences
本研究分析的146 尾从越南和我国华南地区采集的鲫样本分属于6 个鲫线粒体谱系，其中中国境内的样本分属于5 个谱系，余下的1 个谱系分布限于越南的南部。福建、广东、广西采集的样本多属于C1A 或C1B，只有少数个体携带其他谱系的线粒体DNA。这部分个体所携带的线粒体谱系都有各自已知的集中分布区[4,5]，且与越南和华南地区相距较远。因此，本文认为C1A 和C1B 是华南地区的土著类型，而C1B 和C1C 则是越南鲫的主要谱系，谱系C1B 即Rylková 等[10]鉴定出的越南北部谱系，越南南部的鲫则属于另一个谱系（C1C）。Rylková 等[10]虽然注意到Gao 等[5]的论文，但是只将其中的越南样本纳入分析，忽视了Gao 等[5]采集的福建样本，更没有与已知的其他鲫谱系一并考察，因此该研究只注意到越南南部和北部的鲫属于两个不同的谱系。本研究系统分析后发现，多数福建样本属于C1A，既不与越南南部（C1C）相同，也不属于越南北部的谱系（C1B）。本研究结果显示：谱系C1A 主要分布于福建，C1B 为越南北部类型，C1C 为越南南部类型，而两广地区则是C1A 和C1B 的交汇区。
本文直接采集的样本不算多，但是综合前人的研究，认为上述观点能够反映这一区域的真实状况。Gao 等[5]采集的、认为同属于C1 谱系的越南鲫样本，携带的线粒体DNA 属于越南南部类型（C1C），与上述观点一致。而Rylková 等[10]指出越南南部和北部的鲫分别属于不同线粒体DNA 谱系，其采集的广西鲫样本与越南北部鲫属于同一谱系（C1B）。Rylková 等[10]也认为C1B 向北可以达到中国南方。本文采集的两广样本多数属于C1A 或C1B，即一部分线粒体DNA 与福建鲫的主要谱系（C1A）相同，一部分与越南北部相同（C1B），也与上述观点一致。不论是按照地理来源，还是线粒体DNA 谱系归属来划分，本文所分析的鲫样本均表现出较高的遗传多样性。综上所述，三项研究的独立采样分析结果是一致的，均符合本文指出的三个土著谱系的分布格局。
值得注意的是，除了上述三个主要的土著鲫谱系外，这一区域中还检测到了一定比例的其他线粒体谱系。如福建群体中有约16%的个体属于C4 谱系[5]，而本研究在两广地区采集的样本中有少量的C2 和C6 谱系，甚至越南的样本中也有少数个体属于C6 谱系。鲫不同线粒体谱系有自己的集中分布区，但是也存在着一定的谱系混杂。这种谱系混杂即可能是自然过程，也可能是人类活动引起的，或两者共同作用的结果[4,5]。C4 谱系主要分布于琉球群岛，同时在中国中东部地区也有分布。琉球群岛现在虽然与亚洲大陆隔海相望，但是历史上曾多次有陆桥相连接，与中国中东部地区的直线距离并不遥远[4,5]。福建群体中出现较高比例C4 谱系，推测主要是自然过程所致。至于C2 和C6 是在中国分布范围最广的鲫线粒体DNA 谱系[5]，我国养殖最广泛的银鲫和金鱼，其线粒体DNA 就分属于C2 和C6 谱系[4,5,17]。银鲫和金鱼养殖逃逸，对土著鲫造成威胁和遗传污染已在国际上引起了关注[18-24]。本文认为，在广东、越南等地群体中出现C2 和C6 谱系的线粒体DNA，可能主要是人类活动的结果。
本研究显示：华南地区和越南共存在3 个土著的鲫线粒体谱系（C1A、C1B 和C1C），而不是之前认为的1 个或2 个，进一步揭示了鲫具有丰富的遗传多样性和复杂的系统地理格局，有助于鲫种质资源的保护与利用。鱼类线粒体DNA 母系遗传、缺乏重组的特点，使得其难以解析多谱系混居群体的遗传结构，后续有必要利用微卫星等核基因组遗传标记，进一步探究不同地域鲫的遗传结构。
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