巩龙达，陈凯，李丹，蔡梅，王京文*，张奇春*
（1.浙江大学环境与资源学院，污染环境修复与生态健康教育部重点实验室，杭州 310058；
2.杭州市农业技术推广中心，杭州 310020）
随着中国近40年经济的高速增长，土壤重金属污染在国内受到了更多关注。土壤重金属来源广泛，主要由农业生产、大气沉降和废弃物处理等人为活动引起[1]。根据2014年国家环境保护部和国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》，我国耕地土壤污染点位超标率达19.4%，其中无机污染物超标点位占全部超标点位的82.8%，而无机污染物中点位超标率最高的污染类型是镉（Cd）污染[2-3]。
国内外对土壤重金属修复的主要途径可概括为去除化和稳定化2种，其中：去除化是指从土壤中去除重金属污染物，使其存留浓度接近或达到限量标准；
稳定化是指改变重金属在土壤中的存在形态，使其固定而降低其活性[4]。研究发现，采用钝化剂能够钝化土壤有效态Cd，使其不易被作物吸收；
通常，钝化剂分为有机钝化剂和无机钝化剂[5]。无机钝化剂主要包括碱性物质、含磷物质、黏土矿物和工业废渣，因其价格低廉、效果显著和施用方便等特点，被农业工作者广泛地应用在农田Cd污染修复工作中。有些钝化剂如石灰通过提高土壤pH来影响重金属在土壤中的存在形态，促进重金属转化成沉淀或难溶态，从而降低土壤有效态重金属含量；
有些钝化剂如含磷物质主要通过吸附、沉淀和拮抗作用钝化土壤重金属。研究表明：当在土壤中施加0.5%石灰时，土壤有效态Cd 含量减少了35%[6]；
钙镁磷肥能够将污染的砂壤中有效态Cd 含量降低62.2%[7]。丁永祯等[8]研究发现，赤泥能够减少土壤中有效态Cd 含量，同时抑制植物对Cd 的累积。以往的研究大多通过施加单一的改良剂来治理重金属污染，但单一改良剂容易对土壤造成负面影响，如导致土壤酸碱化或肥力不均。相比于单一改良剂，混合改良剂不仅包含了各改良剂的优点，而且弥补了各自的缺陷和局限性。王艳红等[9]研究发现，石灰与泥炭配施比单施石灰对土壤有效态Cd含量的降低更加有效。杨兰等[10]研究表明，牛粪配施海泡石、石灰或钙镁磷肥比单施牛粪处理的糙米Cd 含量降低50%～70%。以上研究多数是从改良剂的降Cd效果来开展的，较少从微生物角度对混合改良剂的综合效果来开展相关研究。
我们前期通过大量的培养试验，获得了一种由石灰、沸石、钙镁磷肥和生物质炭按照71∶23∶5∶1质量比组成的复合钝化剂M，发现该复合钝化剂对土壤Cd污染农田的修复效果明显高于单一的石灰、沸石、过磷酸盐和生物质炭处理。因此，本研究通过2 年的大田试验，进一步研究复合钝化剂的不同施用水平对水稻吸Cd量、土壤理化性质及土壤微生物群落的影响，验证其综合修复效果，为推广该钝化剂提供科学的数据支撑。
1.1 试验地基本情况
试验地位于浙江省某地Cd 污染农田。该地区属于亚热带季风气候区，光照充足，但雨水较多，年均气温、年均降水量和年均日照时数分别为16.3 ℃、1 373.6 mm 和1 887.6 h。土壤类型为水稻土类潴育水稻土亚类黄斑田土属黄斑田土种。土壤基本性质如下：pH 6.4，含有机质36.9 g/kg；
土壤污染物为重金属Cd，其质量分数为0.3～0.7 mg/kg，平均为0.5 mg/kg，属轻度污染；
其他土壤重金属分别为铬（50.1 mg/kg）、砷（15.6 mg/kg）、汞（0.1 mg/kg）、铅（52.9 mg/kg）。
1.2 复合钝化剂基本组成
将石灰（CaO，纯度97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、沸石（化学人造沸石，粒径≤10.0 µm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、钙镁磷肥（农业肥料，有效P2O5质量分数≥12%）和生物质炭（由在600 ℃容器中有限供氧2 h的竹子制成）以71∶23∶5∶1 的质量比混合成为复合钝化剂M。其中，石灰、沸石、钙镁磷肥和生物质炭中总Cd 质量分数分别为0.9、0.02、1.1、0.2 mg/kg，均符合我国在GB 38400—2019中的规定。
1.3 试验设计
田间试验始于2017 年11 月小麦季，为夏水稻、冬小麦的水旱轮作体系。小麦和水稻品种分别是扬麦19和甬优15。于2019年11月收获水稻后结束试验。试验设5 个处理，每个处理3 次重复。采用随机区组设计，小区面积20 m2（2 m×10 m）。小区间田埂用防水塑料薄膜防渗，四周设保护行，每个小区之间都设有独立的灌排沟渠。具体处理如下：CK（不施用复合钝化剂）；
MR1（复合钝化剂施用量为0.1%）；
MR2（复合钝化剂施用量为0.2%）；
MR3（复合钝化剂施用量为0.5%）；
LM（石灰施用量为0.5%）。复合钝化剂M的制备方法已被授权了国家发明专利（ZL201711093771.X），由实验室自行制备。分别在2017年和2018年小麦播种前将复合钝化剂和石灰按用量人工撒施于土壤表面，之后利用耕作设备多次翻耕表层土壤使其充分混合。所有小区的种植和田间管理与当地农户大田生产保持一致。于2018 和2019 年分别进行小麦和水稻测产，并于2019年水稻收获后采集土样和植株样。对所采集的新鲜土壤样品，一部分储存于－80 ℃冰箱中，用于微生物分析；
一部分经自然风干，碾压均匀，并过2 mm 筛后，用塑料袋密封保存，用于基本理化性质指标分析。
1.4 测定方法
1.4.1 土壤和植株样品分析
土壤pH采用去离子水提取（水土质量比为2.5∶1），pH 酸度计测定；
土壤有效态Cd 通过CaCl2提取，微波消解法消解，然后采用AA800石墨炉原子吸收光谱仪（美国PerkinElmer公司）测定；
其他基本理化性质指标采用《土壤农业化学分析方法》[11]测定。植株Cd采用湿式消解法（GB 5009.15—2014，硝酸与高氯酸体积比为9∶1）消解，石墨炉原子吸收分光光度计测定[11]。
1.4.2 土壤磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acids,PLFAs）分析
采用BUTLER 等[12]的方法提取土壤中的磷脂脂肪酸。操作步骤为：先把新鲜土样放在－80 ℃冰箱中冷冻，干燥后过100目筛，称取3.000 0 g干燥的土壤样品并放置于干净的玻璃试管内，用氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液（体积比1∶2∶0.8）振荡浸提，将提取出的脂质通过硅胶柱，使用层析法分离出磷脂脂肪酸，经碱性甲酯化后通过6890N 气相色谱仪（美国Agilent 公司）分析各种脂肪酸的含量。通过总PLFAs 浓度估算微生物量，并利用PLFAs 谱确定微生物群落组成。选用15：0、a15：0、i15：0、i16：0、17：0、a17：0、i17：0、cy17：0、cy19：0、16：1ω7c和18：1ω7c表示细菌生物量[13]。以脂肪酸18：2ω6，9c表示真菌生物量[13]。采用10Me16：0、10Me17：0、10Me18：0 脂肪酸表征放线菌生物量[14]。以计算出的特定的PLFAs比率作为环境压力的指标[15]。以总饱和PLFAs/不饱和PLFAs[S/M，（14：00+15：00+16：00+17：00+18：00+20：00）∶（16：1ω9c+16：1ω7c+16：1ω5c+17：1ω 8c+18：1ω9c+18：1ω7c+18：1ω7c+18：1ω11c+20：1ω 9c）] 和 异（iso）PLFAs/反 异（anteiso）PLFAs[i/a，（i15：0+i17：0）∶（a15：0+a17：0）]作为养分周转和土壤生态系统功能稳定性的指标[16]。计算香农-维纳多样性指数（H′）并将其作为微生物群落多样性的指标。公式如下：
式中：s为在群落结构中发现的PLFAs种数，pi为第i种PLFA含量与总PLFAs含量的比值。
1.5 数据分析
使用植株地上部的有效态Cd 质量分数（Cshoot，mg/kg）和根部的有效态Cd 质量分数（Croot，mg/kg）计算Cd 转运系数（translocation factor, TF），计算公式为TF=Cshoot/Croot。使用植株体内的Cd 质量分数（Cplant，mg/kg）和土壤表层Cd 全量（Csoil，mg/kg）计算生物富集系数（bioconcentration factor, BCF），该系数是化学物质在生物体内累积程度的指标，计算公式为BCF=Cplant/Csoil。采用Origin 2021软件对数据进行主成分分析（principal component analysis,PCA）、冗余分析（redundancy analysis, RDA）和制图，并用SPSS 20.0软件对数据进行显著性分析。
2.1 复合钝化剂施用水平对作物产量的影响
由表1可以看出：在2018年的2季作物中，小麦季在施加复合钝化剂后产量均高于对照（CK），增产幅度为1.7%～24.9%，而施加石灰（LM）后产量有所下降；
水稻季各处理的产量之间没有显著差异，但LM 处理的产量最低，比CK 处理的产量降低了8.4%。在2019 年的2 季作物中，小麦季LM 处理的产量显著下降，与CK 相比降低了29.4%；
水稻季产量在MR1 处理中有所增加，在其余处理中有所降低，但各处理间都没有达到显著性差异。综合2 年的试验结果表明，施用石灰存在减产风险，复合钝化剂施用量高于0.2%对产量有所影响，这可能与复合钝化剂配方中石灰含量较高有关。
表1 复合钝化剂不同施用水平下作物产量Table 1 Crop yields under different application levels of mixed amendment kg/hm2
2.2 复合钝化剂施用水平对土壤理化性质的影响
从表2中可以看出：通过2年的试验，MR3复合钝化剂处理的土壤有机质含量较CK 增加了6.4%，MR1、MR2 和LM 处理的土壤有机质含量无显著性差异，说明少量添加复合钝化剂和石灰对土壤有机质含量无显著影响，而随着复合钝化剂施用量的增加，土壤有机质含量有一定的增加，表明复合钝化剂有利于土壤有机质的积累。与CK 相比，MR1 和MR2 处理的土壤有效磷含量分别增加了13.4%和12.6%，而LM处理的土壤有效磷含量减少了16.7%。各处理的土壤全氮和阳离子交换量没有明显差别。此外，施用复合钝化剂和石灰均会提高土壤pH，相较于CK，MR1、MR2、MR3 和LM 处理的土壤pH 分别提高了6.2%、6.2%、9.2%和9.2%。由此可知，在一定范围内随着土壤钝化剂施用量的增加，土壤pH 也随之逐渐提高，而施用石灰对土壤pH 提高明显。
2.3 复合钝化剂施用水平对土壤有效态Cd 含量和水稻吸Cd 量的影响
与CK 相比，MR1、MR2、MR3 和LM 处理的土壤有效态Cd 含量分别减少了32.5%、24.1%、36.1%和39.2%（图1A），其中LM下降最多，MR3和LM无显著性差异，与各处理使土壤pH 提高的变化趋势相反。对水稻样品的秸秆、籽粒和根分别进行Cd含量分析，结果（图1B）发现：施加复合钝化剂和石灰对水稻各部位Cd含量均有降低作用。与CK相比，MR1、MR2、MR3 和LM 处理的秸秆中Cd 含量下降幅度分别为11.9%、10.7%、20.5%和19.5%，根中Cd含量下降幅度分别为10.7%、11.9%、20.5%和19.5%，籽粒中Cd含量下降幅度分别为42.9%、57.1%、71.4%和72.1%，其中MR3 处理在秸秆和根中的下降幅度最大，在籽粒中的含量与LM处理没有显著性差异。
转运系数和生物富集系数是评价钝化剂改良效果的重要指标。从表3 可知：与CK 相比，钝化剂处理的转运系数降低了14.3%～42.9%，表明钝化剂会显著影响重金属在植物各器官中的迁移能力；
各处理的Cd转运系数按从大到小顺序排列为CK＞MR1＞MR2=LM＞MR3，以MR3处理效果最佳。水稻籽粒的生物富集系数从高到低依次为CK＞MR1＞MR2=MR3=LM。可以看出：CK处理的生物富集系数高于所有处理；
而生物富集系数最低的是MR2、MR3 和LM，与不施肥处理（CK）相比降低了66.7%，达到了显著差异（P＜0.05）。这说明复合钝化剂会不同程度地降低水稻籽粒对Cd的生物富集系数。
2.4 复合钝化剂施用水平对土壤微生物群落的影响
通过PLFAs 分析（表4）发现：0.5%的复合钝化剂施用量（MR3）和单一石灰施用（LM）减少了土壤的真菌数量；
与CK 比较，LM 处理的真菌数量减少了26.5%，而MR1和MR2处理的真菌数量与CK没有显著性差异。与CK相比，MR2和MR3处理的细菌数量有所增加，而LM 处理的细菌数量减少19.5%；
MR1、MR2、MR3 和LM 处理的放线菌数量分别比CK 减少5.6%、18.1%、4.0%和11.3%；
随着复合钝化剂施用量的增加，土壤革兰氏阳性菌的数量明显增加，其中MR3 处理的革兰氏阳性菌的数量达56.5 nmol/g。从表4 还可以看出，总微生物量随着复合钝化剂施用量的增加而显著增加，而LM 处理降低了土壤总微生物量。
进一步对PLFAs 数据集进行主成分分析、聚类分析、香农-维纳多样性指数分析及冗余分析。从图2A 可以看出，主成分分析的2 个主因子PC1 和PC2 分别解释了土壤微生物群落59.7%和22.6%的变异，其中，CK 处理集中在第四象限，MR3 处理集中在第一象限，而MR1、MR2、LM 处理则集中在第二、三象限交界处，说明各处理土壤微生物群落结构表现出一定的差异。聚类分析发现，各处理聚为2 大类，其中CK 和MR3 处理的微生物群落虽然有一定的差异，但可归为一类（图2B）。香农-维纳多样性指数是研究群落物种及其个体数和分布均匀程度的综合指标，是目前应用最为广泛的群落多样性指数之一。可以看出，LM处理的香农-维纳多样性指数相对较低，但与其他处理相比，没有达到显著性差异（图2C）。冗余分析（RDA）结果（图2D）表明：土壤微生物群落结构与土壤有效态Cd 含量、pH、有机质和有效磷的含量显著相关，这几种环境因子解释了86.7%的PLFAs 数据变化；
革兰氏阳性菌与土壤有效磷含量、pH 和有机质含量呈正相关（P＜0.01，P＜0.01，P=0.04），但与有效态Cd 含量呈负相关（P=0.07）。
3.1 复合钝化剂不同施用水平对土壤性质的影响
从2 年的田间试验结果可以看出，施用复合钝化剂可显著增加土壤有效磷含量，MR3处理还可显著增加土壤有机质含量，而石灰的施用降低了磷的有效性。同时，复合钝化剂处理后土壤pH 有不同程度增加，土壤有效态Cd 含量降低，且随着施用量增加土壤有效态Cd降低越明显，说明复合钝化剂和石灰的钝化机制相似[17]，主要通过增加土壤pH来降低土壤中有效态Cd含量。土壤pH影响土壤的吸附解吸、沉淀溶解、电荷及配位平衡等，从而影响土壤中重金属形态变化[18-19]。而土壤pH增加，会促进土壤中有效态Cd 转化成植物难以吸收的难溶态Cd。与CK 相比，经复合钝化剂和石灰处理后，土壤pH提高了6.2%～9.2%，主要原因是石灰在土壤中经过反应会电离出氢氧根离子[20]，从而提高土壤pH，而土壤的有效态Cd含量则减少了24.1%～39.2%。总体来看，复合钝化剂施用量增加可提高土壤有机质含量和有效磷含量，对土壤全氮和阳离子交换量影响不大，却明显降低了土壤有效态Cd 含量；
而石灰在降低土壤有效态Cd含量的同时，也影响了土壤养分的有效性。
3.2 复合钝化剂不同施用水平对水稻吸Cd 量的影响
作物从土壤中吸收各类营养元素的同时，自身不需要的元素也会累积，例如重金属Cd。植物吸收各类元素受到多种因素的影响，其中元素的存在形态是关键因素。在本研究中，复合钝化剂和石灰均能显著降低水稻籽粒和秸秆中的Cd含量，且随着复合钝化剂施用量的增加，水稻籽粒和秸秆中Cd含量明显减少。其中：MR3 处理的水稻秸秆Cd 含量最低，LM 处理的水稻籽粒Cd 含量最低，且MR3 和LM处理的土壤pH高于其他处理，这说明土壤的pH越高，土壤中有效态Cd 含量越少，即易被植物吸收的生物可利用态Cd 越少[21]，植物体内累积的Cd 含量就越少。转运系数（TF）是Cd元素在植株地上部含量与根部含量的比值，用于评估重金属从植株根部向地上部转移的能力，TF和生物富集系数（BCF）值越大，重金属转移越容易，从而对植株产生不利影响。本研究结果表明，钝化剂可显著降低Cd在水稻各器官中的迁移能力和水稻籽粒对Cd 的生物富集系数。此外，复合钝化剂中钙镁磷肥的磷酸根离子可以与Cd 离子生成磷酸盐沉淀，可以降低Cd 的有效性；
生物质炭表面具有活性基团与孔隙[22]，有利于吸附重金属Cd。从本试验结果可以看出，单独施用石灰也可明显降低水稻对Cd的吸收，但是施用石灰在增加土壤pH的同时会降低土壤养分如磷的有效性，并且对土壤微生物群落产生消极影响，如降低土壤微生物群落多样性、减少真菌和细菌的生物量等，从而影响作物产量。
3.3 复合钝化剂不同施用水平对土壤微生物群落的影响
复合钝化剂施用不仅通过增加pH 减少了土壤中有效态Cd含量，还对土壤中各类微生物群落产生了影响。磷脂脂肪酸（PLFAs）技术是一种借助生化手段的微生物生态学研究技术，它对细胞生理活性及保存时间的要求不高，样品中所有微生物都能够提供有效的信息，分析过程快捷，结果可靠[[23-25]。本研究通过PLFAs 的变化阐述了复合钝化剂对土壤微生物的影响。结果表明，施用0.5%的复合钝化剂和石灰减少了真菌数量，这可能与土壤pH 的增加有关[26]。已有的研究表明，土壤pH 会对土壤细菌、放线菌等其他菌落数量产生影响[26]。本研究也发现：石灰施用减少了土壤微生物细菌、放线菌等的数量，导致土壤总微生物量、多样性指数呈降低趋势；
而MR2 和MR3 处理的土壤总微生物群落数量却没有下降，且总量明显增加，表明复合钝化剂配方中的其他物质可以抵消石灰对微生物的负面作用。从PCA的结果中可以看出，LM和MR3处理对土壤微生物产生明显不同的影响，MR3处理的PLFAs多样性水平和物种丰富度与CK 相似，但其S/M、G+/G－和i/a比值显著低于CK。G+/G－比值的降低可能表明从贫营养状态到营养状态的逐渐变化[27]，这与复合钝化剂成分的多样化一致。MR3 处理中S/M和i/a比值明显降低，表明复合钝化剂支持更快的养分周转率[15]。据报道，随着石灰施用量增加，微生物的丰度趋于减少，尤其是在酸性土壤中[28]，本研究结果与其一致。可见，MR3处理不仅具有更高水平的微生物群落多样性，而且具有更多的营养条件和更快的养分周转率，这可能是其配方中的磷肥与生物质炭的交互作用对土壤微生物群落结构产生了影响。土壤微生物群落指标与土壤环境因素之间的冗余分析（RDA）为以上结果提供了证据。RDA结果显示，土壤有机质含量与S/M、i/a 之间呈显著负相关（P＜0.01，P=0.04），但土壤有效磷和细菌、真菌、总微生物量、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的数量之间呈显著正相关（P=0.05，P=0.03，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），表明复合钝化剂中的磷肥和生物质炭可能改善了土壤微生物群落结构。有研究表明，磷矿改性后的土壤可以促进微生物群落的发展，从而促进植物生长[29]。在高原草原的农业管理过程中，磷酸盐的施用对微生物群落结构变化起着至关重要的作用[30]。生物质炭可以通过促进增磷细菌数量增加细菌家族的丰度，促进碳、氮和磷的生物地球化学循环，从而降解更多的顽固碳化合物[31]。但在本研究中沸石、钙镁磷肥和生物质炭在MR1和MR2 处理中效果不明显，可能与三者在MR1 和MR2处理中含量较低而其作用被石灰掩盖有关，这也是在PCA中MR1、MR2和LM处理紧密聚集的原因。而在MR3 处理中，它们显示出了显著的效果，即MR3 处理与LM 处理对土壤有效态Cd 的钝化作用相似，且MR3处理的微生物丰富度显著高于LM。
通过2 年的大田试验，将不同施用量的复合钝化剂与石灰施用效果进行对比。结果表明，复合钝化剂和石灰相似，能够增加土壤的pH，明显降低土壤有效态Cd 含量和水稻籽粒、秸秆中Cd 含量，达到安全生产的目的。并且在一定范围内，随着复合钝化剂施用量的增加，土壤有效态中Cd 含量和水稻籽粒中Cd 含量逐渐减少。同时还发现，复合钝化剂有利于土壤有机质积累，增加土壤磷的有效性，并提高了土壤中细菌和革兰氏阳性菌等的生物量，而单一的石灰处理虽然对土壤有效态Cd 具有明显的钝化效果，但也明显降低了土壤总微生物量和微生物群落多样性。综合考虑，推荐施用0.2%复合钝化剂，它能够在改善土壤理化性质和土壤微生物群落结构、增加水稻产量的前提下，有效地降低水稻籽粒中的Cd 含量，对农田Cd 污染土壤的修复具有良好的效果。由于本研究只是施用2 年的结果，对于该复合钝化剂的长期效果有待进一步研究。
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