刘 悦，张 灿，高玲玲，张康逸，闫美慧，张国治*
1．河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2．河南省农业科学院 农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002
老面是选用小麦粉、大米、玉米粉、麸皮等谷物作为基底，以一定比例与水混合，经过自然发酵风干后形成，在北方大多沿用传统老面酵头发酵技术，赋予馒头独特的质地和浓郁的风味，深受消费者的喜爱[1]。风味作为馒头的重要感官属性之一，直接决定了消费者对食品的选择。
发酵米面制品中风味物质的形成主要有以下4种途径：脂肪氧化、热处理、微生物代谢及酶系生物转化[2]。老面面团具有复杂的生化体系，馒头风味物质的形成离不开微生物的代谢参与。老面发酵过程中乳酸菌和酵母菌的单一作用或相互作用会产生风味化合物[3]。研究表明老面面团的发酵过程可有效降低脂肪氧化，一些乳酸菌可还原脂肪氧化化合物为相应的醇类物质[4-6]。酵母菌主要产生醇类物质，乳酸菌则通过代谢作用产生酸类、呋喃类及少量醚类物质[7-8]。Ripari等[9]还发现乳酸菌可代谢生成2-戊基呋喃、己酸、己醇以及酯类等风味物质。Plessas等[10]研究发现乳酸菌发酵后产生多种酯类化合物，乳酸菌的繁殖与酯类物质的生成具有相关性。此外，Stadie等[7,11]研究表明，老面发酵面团中菌群间的相互竞争与促进对风味物质的形成有较大关联，环境的变化使得微生物产酶量与酶活性发生变化，从而影响香气化合物的产生。
目前，对于老面馒头的风味、微生物多样性以及不同类型老面对馒头风味的影响研究较多，然而，对其发酵过程中微生物菌群代谢作用与挥发性物质间的关系研究相对较少。因此，作者基于老面对馒头风味的影响，旨在通过传统培养、高通量测序结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，分析发酵过程中菌群的动态变化与风味物质间的相关性，进而探索老面馒头风味形成机制，为面制品风味发酵研究提供理论依据。
1.1 材料
特一粉：河南金苑粮油有限公司；
高活性干酵母、馒头改良剂：安琪酵母股份有限公司；
老面(原料为玉米面、面粉、米酒及甜瓜曲)：新乡市红旗区忆味土特产；
双效泡打粉：桂林市红星化工有限责任公司；
白糖：广州福正东海食品有限公司；
仲辛醇：上海源叶生物科技有限公司；
葡萄糖：天津市风船化学试剂科技有限公司；
平板计数琼脂培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器
MP 5002 电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
HM 740海氏厨师机：青岛汉尚品牌管理有限公司；
FJ-YH面包醒发箱：广东乐创电器有限公司；
GC-7890A气相-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；
50/20 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头：美国色谱科公司；
YXQ-LS-75S11立式压力蒸汽灭菌锅、SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；
Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；
PB-10酸度计：德国赛多利斯有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵面团的制备
L样品：复配老面面团(DY(dough yield)=面团质量×100/面粉质量=153；
水分含量39.9%)。和面(将面粉100 g、酵母1 g、泡打粉0.25 g、改良剂0.25 g、白砂糖0.25 g及老面水0.25 g混匀)→醒发(35 ℃，RH 85%，40 min)→取样(醒发0、10、20、30、40 min时称取)→装袋，-40 ℃冻存。
A样品：酵母发酵面团(DY 153，水分含量39.0%)。制作方法参照L样品，仅和面时未加老面水，其余均保持一致。
1.3.2 发酵面团微生物检测
1.3.2.1 微生物的传统分离培养与保存
参照GB 4789.2—2016测定发酵面团中菌落总数，对平板培养中优势单菌落进行纯化培养，-40 ℃保存。
1.3.2.2 微生物群落鉴定
参考邢小龙[12]的方法，菌株活化后采用DNA试剂盒提取细菌的DNA，进行菌种鉴定。
1.3.2.3 高通量序列分析
1.3.3 面团pH值、总酸度和还原糖含量的测定
参考Liu等[14]的方法测定发酵面团的pH值及总酸度(TTA)；
采用3, 5-二硝基水杨酸法[15]测定发酵面团的还原糖(RS)含量。
1.3.4 发酵面团风味物质的测定与分析
采用GC-MS测定，内标物为仲辛醇(200 mg/L)，参数设置参照冯涛等[16]的方法，并稍加改动。
样品前处理：称取面团3 g，加入10 μL 200 mg/L仲辛醇为内标物，老化30 min，吸附30 min，解吸6 min，进样检测。
色谱条件：色谱毛细管柱为DB-5MS(60 mm×0.32 mm, 1 μm)；
起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。载气流量0.8 mL/min，压力3.29×104Pa，进样口250 ℃，运行41 min。
质谱条件：电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围35～450 m/z，溶剂延迟3 min。
1.4 数据处理
使用SPSS 21 对数据进行统计学分析，采用Origin 8.0、Tukey’s、Hiplot分别进行制图、显著性差异和相关性分析。
2.1 传统培养发酵面团中菌落总数的鉴定及理化指标测定
2.1.1 传统培养分离细菌鉴定结果
由表1可知，A样品菌落总数从初始的5.6×107CFU/g升至3.2×108CFU/g，L样品从6.4×107CFU/g升至5.8×108CFU/g。A样品中有杆菌属和球菌属，分别为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、柠檬色短小杆菌(Curtobacteriumcitreum)及腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)，并且随着发酵的进行，腐生葡萄球菌逐渐成为优势物种，而柠檬色短小杆菌在20 min后逐渐被其他种群取代。添加老面后与未添加对比发现，有胶红酵母属(Mucilaginosaisolate)生长繁殖，并且菌属逐渐增多，柠檬色短小杆菌成为优势菌种，与张国华[17]的研究结果一致。柠檬色短小杆菌多存在于小麦制品及水稻种子中，由于老面发酵工艺经过玉米、小麦等杂粮混合后接种米酒等发酵培养，体系富含多种乳酸菌、醋酸菌，与A样品相比，发酵力相对较弱，但发酵过程中的菌种代谢产生更多醛、酮、酯类等风味物质，使得蒸制馒头口感质地细腻，味道香醇可口[18]。
2.1.2 发酵面团还原糖含量、总酸度、pH值的变化
面团发酵中的糖类物质来源分为3类：面团多样微生物分解中利用自身或发酵所产生；
面团中所含淀粉酶水解淀粉后产生；
代谢所产生的热量影响面团体系糖平衡后产生[19]。由图1a可知，A样品RS变化呈现波动趋势，在发酵10 min时达到最大值，L样品呈先降低又升高而后降低的趋势，在发酵20 min时达到峰值(1.13 g/100 g)，由于面粉中富含淀粉酶，在微生物生长至对数期时，淀粉酶活及水解能力最高，随着细菌丰度、多样性增加，RS生成速率高于消耗速率，导致RS含量增加，与李志建等[20]的研究结果一致。添加老面后，微生物体系多样性增加，菌种利用面团氧气进行有氧呼吸生成醋酸、CO2等酸性物质，面团产气能力逐渐增强，pH值降低。由图1b可知，随着面团酸性增强，嗜酸微生物乳酸菌、醋酸菌逐渐增多，L样品pH值降到最低值(5.02)，此时还原糖含量为1.17 g/100 g。
表1 基于 16S rRNA 基因测序的细菌菌种鉴定Table 1 Identification of bacterial strains based on 16S rRNA gene sequencing CFU/g
图1 面团发酵过程中RS含量、TTA及pH值的变化Fig.1 Changes of RS and TTA content and pH value during dough fermentation
2.2 发酵面团高通量测序鉴定细菌群落多样性差异
2.2.1 样本群落多样性及丰度分析
由图2a、2b可知，Rarefaction和 Shannon[21]曲线都趋于平坦，证明结果足以覆盖所有的菌种信息。由图2c可知，2种样品曲线陡峭，表明物种分布不均匀，且物种之间的丰度存在差异。
2.2.2 α多样性指数分析
由表2可知，Coverage指数均大于0.999，表明结果可反映样品中的真实情况。ACE指数和Chao1指数在A样品中呈先升高后降低趋势，在L样品中呈先降低再升高趋势，说明在发酵过程中面团内物种的丰度可能是随着发酵进行而波动的，老面面团中的乳酸菌在最适生长条件下生长繁殖，一些适宜在较低温、中性环境下生长的菌属逐渐消亡。
表2 发酵面团样品中细菌 α 多样性分析Table 2 Analysis of bacterial α diversity in yeast dough samples
Shannon 指数和 Simpson 指数反映发酵过程中物种多样性变化趋势，Shannon指数越大，Simpson指数越小，多样性种类不确定性越大，表明物种多样性高。
结合表1可知，在发酵初期，随着菌落总数的升高，物种多样性有所降低，随发酵面团pH值降低及温度缓慢升高，一些耐酸、耐热菌属逐渐增多。发酵后期，细菌生长从对数期进入稳定期，生长速率不变，菌落总数呈比例升高，多样性增加，某些菌种在适宜条件下成为优势菌，有些菌群逐渐消亡，以此消彼长的状态维持细菌总数的平稳。
2.2.3 细菌群落组成分析
在目和属水平上物种丰度前10的群落组成见图3。由图3a可知，从目水平看，乳杆菌目(Lactobacillales)和拟杆菌目(Bacteroidales)在添加老面的体系中占优势地位，乳杆菌目相对丰度7%，在未添加老面的体系中几乎未检出。L30的拟杆菌目相对丰度达到峰值10%，可能与老面体系中添加米酒酒曲后还原糖含量降低有关。张海燕等[22]在研究中检测出与试验相同的叶绿体序列，并提出原因可能是过程中添加曲种或发酵、干制时环境所带来。刘同杰等[23]通过对传统酸面团鉴定，发现乳杆菌目为其中关键微生物，与图3a结果类似。宁亚丽等[24]研究发现肠杆菌为酒曲中的优势细菌，对酸味的产生有重要作用。由图3b可知，添加老面后，L样品中出现新的乳酸杆菌(Lactobacillus)，且随时间延长，保持较高相对丰度，在10%左右波动，可将乳酸杆菌看作L面团中的优势菌属。在酸面团发酵过程中乳酸杆菌常被发现，并与柠檬色短小杆菌等细菌相互促进[25-26]。
2.3 发酵面团风味物质的测定
由表3可知，面团中有21种醇类、42种烃类、30种酯类、2种呋喃类、11种醛类、7种酮类、4种酚类、2种醚类及5种其他类别，共124种风味物质，醇类和酯类相对含量较高，可认为是面团发酵过程中的关键香气成分。随着发酵时间的延长，L面团中醛类风味物质略微下降，A面团中烃类略微下降，其余总体基本不变，比较L面团中挥发性物质种类和含量发现，适量添加老面后面团的风味物质增加，从而提升蒸制后馒头的风味。醇类在环境中不稳定、易挥发而较易在香气检测中捕获，面团中醇类物质的产生主要源于可发酵糖源的代谢作用。在面团发酵后期，体系中酵母菌、乳酸菌通过直接参与代谢或结合电子受体参与代谢，还原内部醛类物质为醇类、酸类物质，面团体系风味物质多样性增加[27-28]。酯类风味物质的产生主要来源于酸类物质与醇类物质的化学反应，面团发酵过程中脂肪酸与乙醇作用，使面团产生坚果类及环状芳香类气味[29]。棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和酞酸二丁酯为老面面团中相对含量较多的特征风味成分，酯类的产生可能来源于发酵过程中杆菌、酵母菌的生长繁殖，面团中脂肪酸代谢作用增强[30]。面粉中本身含有少量的油脂成分及不饱和脂肪酸，通过氧化反应生成氧化物，发酵时酵母菌种类及数量增加，酶作用增强，生成醛、酮类物质。醛类物质大多具有果类、绿叶草本类等风味；
酮类、酚类物质大多具有酸味、坚果类、水果类香气，但其呈香作用弱，在馒头整体香气特征中表现不明显[31-32]。
图3 目和属水平的群落组成和相对丰度Fig.3 Community composition and relative abundance at the order and genus levels
表3 面团发酵过程挥发性风味物质GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of volatile flavor compounds during dough fermentation
续表3
综合各类香气成分的变化可以得出，微生物复杂程度的增加、体系内生化反应的进行有利于风味的产生，起主导作用的是酯类、醇类、醛类等风味成分，相对含量存在差异。随发酵时间延长，老面面团中酯类物质逐渐增多，醇类、醛类物质逐渐减少，可能是造成老面馒头具有特殊香气的主要原因。添加老面后，面团风味物质种类变多，通过物质之间相互协调，赋予了馒头独特的风味和口感。
2.4 发酵面团挥发性成分与微生物相关性分析
由图4可知，柠檬色短小杆菌与醇类负相关，与醚类、醛类正相关；
蜡样芽孢杆菌与醇类、醛类正相关，与呋喃类负相关；
胶红酵母与酮类、酯类、醛类正相关，与烃类、呋喃类负相关；
腐生葡萄球菌与酚类、呋喃类正相关，与酯类负相关。由此可见，发酵过程中风味物质的变化与微生物群落结构的变化具有相关性，说明微生物改变是影响风味变化的一项重要因素。对面团发酵过程中的微生物进行调控，为进一步研究微生物菌群结构对风味物质形成的机理提供理论依据。
图4 风味物质与微生物间相关性热图Fig.4 Heat map of the correlation between flavor components and microorganisms
基于传统培养和高通量测序对微生物多样性及菌群结构分析表明，老面的添加提高了发酵过程中胶红酵母及柠檬色短小杆菌的菌落数。微生物多样性的提高有利于发酵面团风味的改善。采用GC-MS法共检测到124种挥发性风味物质，老面的添加使得风味物质的种类及数量增多，酯类、醛类、醇类尤其明显。与酵母面团相比，老面面团在缩短发酵时间的同时，能赋予新的风味及增强特征香气浓度。微生物菌群多样性与老面馒头风味相关性分析表明，微生物菌群多样性与挥发性香气物质组成具有显著相关性。本研究通过对未添加和添加老面的面团发酵过程中微生物多样性及风味物质的变化进行比较分析，为进一步研究菌群信息及提升馒头特征风味和品质优化提供理论参考，对开发生产老面馒头工业化风味发酵剂提供理论依据。
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