颗粒粒径对荷叶不溶性膳食纤维结构、理化及感官品质的影响

郑 慧,孙 艳,张眙曼,李娅迪,肖 玥,蒋益繁,杨 勇

湖南中医药大学药学院食品药品工程系,长沙 410208

膳食纤维具有调节血糖、降低血脂、预防肥胖、调节肠道菌群等功效,已成为消费者青睐的功能性食品原料。从果皮、蔬菜、芦笋叶、枸杞叶和桑叶等农副产物中提取的膳食纤维,纤维组成多样化且含有植物多酚等抗氧化成分,被誉为抗氧化性膳食纤维,具有更好的功能特性[1,2]。此类膳食纤维来源广泛,合理开发能较大提高农产品的附加值,受到了较多研究者的关注[3]。在逐渐深入的研究中发现不溶性膳食纤维制备过程中较多因素直接影响纤维的结构及其组分,进一步影响其理化功能特性[4]。尤其对于纤维结构相对致密的原料,前期制备过程中的颗粒粒径大小更加至关重要[5,6]。但目前在很多膳食纤维的研究与开发中颗粒粒径对功能特性的影响仍然被忽略。

荷叶为睡莲科植物莲的干燥叶,《本草纲目》记载“荷叶服之,令人瘦劣”,在中国常作为减肥、瘦身、降脂的药品或功能性食品的原材料。荷叶富含多酚类物质和膳食纤维,符合天然优质膳食纤维的来源条件[7]。同时消费者对荷叶的认可度高,荷叶属于药食兼用资源可作为普通食品的辅料使用,开发门槛较低,荷叶膳食纤维作为高纤维食品辅料的可开发潜力较大。膳食纤维大多口感粗糙,为降低对食品感官品质带来的不良影响,膳食纤维常经粉碎甚至微粉化处理后再添加到食品中,一般来说膳食纤维颗粒粒径越小感官评价越高。同时有研究发现颗粒粒径过大或过小都不利于不溶性膳食纤维的功能特性。本文对比分析4种不同颗粒粒径荷叶不溶性膳食纤维(lotus leaf insoluble dietary fiber,LIDF)的结构、功能成分含量、体外吸附特性和食用感官品质,筛选LIDF作为高纤维食品辅料适宜的颗粒粒径,为后期荷叶膳食纤维的深入研究提供参考。

1.1 材料与试剂

干荷叶,购于湖南振兴中药有限公司,为采摘刚舒展开、微微卷边的嫩荷叶,无熏硫,自然晾干而成;
芦丁、原儿茶酸(AR,上海跃腾生物技术有限公司);
α-淀粉酶(BR,CAS 9001-19-8)、淀粉葡萄糖苷酶(BR,CAS 9032-08-0)、蛋白酶(BR,CAS 9068-59-1)(上海源叶生物科技有限公司);
三羟甲基氨基甲烷(BR)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(AR)、福林-酚(BR)、胆固醇(AR)、氯化钠(AR)、冰乙酸(AR)(国药集团化学试剂有限公司);
总膳食纤维测定试剂盒(爱尔兰安诺伦生物科技有限公司)。

1.2 主要仪器与设备

FW100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);
Bettersize2600E激光粒度分布仪(丹东百特仪器有限公司);
EVO18扫描电子显微镜(德国蔡司公司);
NicoletiS5傅里叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技公司);
D8 advance X射线衍射仪(德国布鲁克AXS公司);
TDZ5-WS型台式低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司);
UV 2450紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司);
CS-820N色度仪(杭州彩谱科技有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 LIDF的提取

参考GB5009.88-2014提取LIDF,方法略有改动。干荷叶经干法剪切粉碎不同时间筛分得到100~150目、150~200目、200~250目以及250目以上4种颗粒粒径的荷叶粉。分别取此4种荷叶粉10.000 g置于1 000 mL锥形瓶中,加入500 mLMES-TRIS缓冲液(0.05 mol/L,24 ℃下pH 8.2)并搅拌分散,加入0.5 mL α-淀粉酶(10 000 U/mL)95 ℃水浴酶解35 min,冷却至60 ℃加入1 mL蛋白酶(400 U/mL)60 ℃水浴酶解30 min,调节pH至4.5,加入1 mL淀粉葡萄糖苷酶(3 000 U/mL)60 ℃水浴酶解30 min,90 ℃水浴灭酶10 min后,4 000 r/min离心15 min取沉淀,置于恒温干燥箱80 ℃下烘至恒重得到100~150目、150~200目、200~250目以及250目以上4种颗粒粒径荷叶粉制备的LIDF,后续分别用LIDF-A、LIDF-B、LIDF-C、LIDF-D表示。

1.3.2 LIDF粒径分布

称取适量的LIDF置于LS-POP激光粒度仪样品槽中,用蒸馏水作为分散剂湿法测定LIDF粒径分布。

1.3.3 结构分析

1.3.3.1 显微结构观察

将LIDF粉末用胶带固定后表面喷金,在扫描电子显微镜下观察其微观结构。

1.3.3.2 红外光谱分析

称取LIDF 2 mg与KBr粉末200 mg于研钵中,混匀并充分研磨,制片。在400~4 000 cm-1,扫描次数32次,扫描分辨率4 cm-1,进行红外光谱分析。

1.3.3.3 X衍射分析

LIDF的X射线衍射分析按参考文献[8]的方法进行操作。扫描参数为靶:Cu-Ka;
步宽:0.02°;
扫描速率:3°/min;
扫描范围2θ为5°~50°。参照参考文献[9]中Segal的公式计算结晶度指数(crystallinity index,CrI)。

(1)

其中,I002为结晶纤维素在2θ约为22.5°时的峰值强度;
Iam为无定形区(非结晶纤维素、半纤维素和木质素)在2θ约为18°时的峰值强度。

1.3.4 LIDF功能成分含量的测定

1.3.4.1 LIDF中不溶性膳食纤维含量的测定

按总膳食纤维测定试剂盒的方法测定LIDF中不溶性膳食纤维含量。

1.3.4.2 LIDF中总多酚和总黄酮含量的测定

称取LIDF 0.500 g置于250 mL锥形瓶中,加入20 mL 70%乙醇溶液,超声功率60%、60 ℃下超声50 min,5 000 r/min离心15 min取上清液。重复以上步骤1次,合并2次上清液,用70%乙醇溶液定容至50 mL,作为LIDF总多酚、总黄酮提取液待测。LIDF总多酚含量的测定按参考文献[10]的方法测定。

分别吸取1、2、3、4、5 mL 0.1 mg/mL芦丁标准溶液置于10 mL具塞试管中,加70%乙醇至5 mL,加5%亚硝酸钠溶液0.4 mL,摇匀后静置6 min;
加10%硝酸铝溶液0.4 mL,摇匀后静置6 min;
加4%氢氧化钠溶液4 mL,70%乙醇定容,摇匀后静置15 min,立即在512 nm波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。取0.5 mL LIDF提取液置于10 mL具塞试管中,后续操作同前。根据标准曲线计算LIDF总黄酮的含量。

1.3.5 LIDF体外吸附特性的测定

1.3.5.1 持水性、持油性的测定

按照参考文献[11]的方法略有改动。称取LIDF 0.500 g置于50 mL离心管中,加入10 mL蒸馏水或大豆油混合均匀。置于漩涡振荡器上震荡30 s,每震荡一次间隔10 min,3次后10 000 r/min离心15 min,将上层溶液倾倒出称重。持水性、持油力的计算均如(2)所示。

(2)

式中:A为LIDF持水力或持油力,g/g;
m0为LIDF的质量,g;
m1为离心管的质量,g;
m2为离心后离心管和下层持水或持油LIDF的质量,g。

1.3.5.2 阳离子交换能力的测定

按照参考文献[12]的方法测定LIDF的阳离子交换能力。

1.3.5.3 对胆固醇吸附能力的测定

按照参考文献[13]的方法测定LIDF对胆固醇的吸附能力。

1.3.5.4 对胆酸钠吸附能力的测定

按照参考文献[14]的方法略有改动。分别量取100、200、300、400、500 μL 1 mg/mL胆酸钠标准溶液置于10 mL具塞试管中,用水补充体积至1 mL,加入6 mL 45%硫酸混合均匀,加入1 mL 0.3%糠醛,65 ℃水浴加热30 min,冷却至室温,在620 nm波长处测定吸光值。以胆酸钠标准溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。称取LIDF 0.500 g置于250 mL锥形瓶中,加入50 mL 0.15 mol/L NaCl溶液(含0.100 g胆酸钠),调节pH值至7.0,37 ℃、150 r/min恒温振荡2 h,5 000 r/min离心15 min。取0.3 mL上清液置于10 mL具塞试管中,采用上述糠醛比色法在620 nm波长处测定吸光值,根据标准曲线计算上清液中胆酸钠的含量。对胆酸钠吸附能力计算公式如(3)所示。

(3)

式中:D为LIDF对胆酸钠吸附能力,mg/g;
Ma为吸附前溶液的胆酸钠质量,mg;
Mb为吸附后上清液中胆酸钠质量,mg;
m为样品的干物质量,g。

1.3.5.5 对葡萄糖吸附作用的测定

采用3-5二硝基水杨酸法绘制葡萄糖标准曲线。分别称取4种LIDF 0.500 g置于锥形瓶中,加入50 mL 100 mmol/L的葡萄糖溶液,在37 ℃、150 r/min下恒温振荡3 h,4 500 r/min转速下离心15 min,取上清液采用上述3-5二硝基水杨酸法测定上清液中葡萄糖浓度。LIDF对葡萄糖吸附能力按公式(4)计算。

(4)

式中:E为对葡萄糖吸附能力,mmol/g;
Ca为吸附前葡萄糖浓度,mmol/L;
Cb为吸附后上清液中葡萄糖浓度,mmol/L;
V为吸附液体积,mL;
m为样品的干物质量,g。

1.3.6 LIDF感官品质分析

1.3.6.1 色度测定[15]

采用色度分析仪测定样品色泽。色度值用CELL*、a*、b*值表示,其中,L*表示明亮度(0为黑,100为白);
a*表示红绿度(a*>0,表示红色程度;
a*<0表示绿色程度);
b*表示黄蓝度(b*>0表示黄色程度,b*<0表示蓝色程度)。每个样品重复测定9次。

1.3.6.2 LIDF食品感官评定

为全面评价LIDF颗粒粒径对食品感官的影响,采用常规基础工艺,制备LIDF液体食品(饮料)、半固体食品(米糊)、固体食品(饼干)三种类型的LIDF食品。具体工艺如下,将3 g LIDF溶入100 mL 0.2%结冷胶溶液中,搅拌均匀制成颗粒均匀悬浮的LIDF饮料;
将3 g LIDF与17 g熟化米粉混合均匀,加入约100 mL沸水冲泡,搅拌均匀制成LIDF米糊;
将3 g LIDF与97 g面粉混合均匀,加入15 g植物油、0.5 g泡打粉、0.5 g小苏打、30 g鸡蛋清混合均匀后揉捏成团,冷藏20 min擀面压型,置于上、下火均为160 ℃的烤箱中烘烤15 min,冷却后制成LIDF饼干。工艺中不添加糖酸调味,重点关注因颗粒粒径对感官品质的影响。选取10名品评员,对产品口感、滋味、外观、香气的影响进行评分,评分标准如表1,满分100分。

表1 LIDF产品感官评定标准

1.4 数据分析

每个试样重复3次,数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析,结果采用平均数±标准差表示。

2.1 LIDF的粒径分布

原料干荷叶为采摘刚舒展开微微卷边的嫩荷叶自然晾干,易于粉碎。预实验发现未过100目筛网的荷叶粉,颗粒较大、口感粗糙,不适合作为辅料用于食品开发。故研究以100目以上筛分得到的4种颗粒粒径荷叶粉为原料提取LIDF,其粒径分布及比表面积如表2所示。LIDF-A、LIDF-B的D50高于100 μm,分别为171.53、100.37 μm;
LIDF-C、LIDF-D的D50低于100 μm,分别为58.35、21.21 μm,同时LIDF比表面积随颗粒粒径减少而增加。4种LIDF的颗粒粒径分布有一定的区分度,结合后续实验可反映颗粒粒径对荷叶膳食纤维相关特性的影响。

表2 LIDF粒径分布及比表面积

2.2 LIDF的结构分析

2.2.1 显微结构观察

4种不同颗粒粒径的LIDF显微结构如图1所示,经酶解后LIDF-A、LIDF-B和LIDF-C表面出现孔洞(见图1中a处),与Ma[4]通过蛋白酶提取孜然膳食纤维以及Wang[16]通过淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶提取猕猴桃膳食纤维的显微结构表面出现孔洞情况相似,可能与原料中非纤维组分被酶解相脉之间的表皮及叶肉部分,孔洞出现部位更具有规律性。LIDF-A和LIDF-B中可观察到荷叶的叶脉纤维多被纵向剪切破碎,LIDF-C和LIDF-D中除纵向剪切破碎外还可观察到荷叶纤维被横向剪切破碎,荷叶内质网格状纤维结构明显暴露出来(见图1中b处)。不溶性膳食纤维主要通过包裹、吸附等物理方式在机体发挥功效,LIDF颗粒粒径不同引起的比表面积差异,以及酶解后出现的LIDF表面孔洞和荷叶内质纤维的破碎程度都可能直接影响LIDF的理化功能特性。

图1 LIDF扫描电子显微镜图(×500)Fig.1 Scanning electron microscopes(SEM) images of LIDF(×500)注:a:叶片表面孔洞;
b:叶脉被横向破碎。Note:a:Holes on the leaf surface;b:Leaf veins are broken laterally

2.2.2 红外光谱分析

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,含有烷烃、酮类、酯类、芳香烃和醇类等多种官能团。通过红外光谱图中不同官能团的特征吸收峰位置和强度能推断基团种类和化学键类型,红外光谱分析已成为表征纤维素结构的常用方法[8]。

从图2可知LIDF具有纤维素的特征吸收峰,4种不同颗粒粒径LIDF的红外光谱图吸收峰的峰形相似,未出现新的吸收峰,表明在本研究颗粒粒径的区间范围内并未有新的官能团出现,并未引起LIDF化学基团的变化。与Huang[17]、Payling[18]的研究一致,食品加工主要影响多糖类组分的宏观结构和微观结构,而不会改变分子结构。其中LIDF在3 348 cm-1左右出现较为延展圆滑的吸收峰,可能与其中的纤维素和半纤维素-OH的伸缩振动有关,进一步可与LIDF具有一定的持水性相关[8]。在2 921 cm-1左右出现弱吸收峰,可能与糖类甲基和亚甲基上-CH的伸缩振动相关,也反映了LIDF存在纤维素和半纤维素结构[19]。在1 616 cm-1左右出现较强吸收峰可能是C=O的特征峰,表明LIDF中含有较多的糖醛酸。在1 417 cm-1左右出现弱吸收峰,可能为-CH弯曲振动峰,可初步推测LIDF中的纤维素晶型为I型[20]。在1 031 cm-1和1 054 cm-1左右出现较强吸收峰,可能是C-O-C中C-O伸缩振动和C-O-H的O-H变角振动。4种不同颗粒粒径LIDF的红外光谱图吸收峰峰形相似、强度略有差异,推测可能4种LIDF中纤维素的结晶状态相同,结晶度有所变化。

图2 LIDF红外光谱扫描图Fig.2 Infrared spectrogram of LIDF

2.2.3 X衍射分析

从植物细胞壁中提取的不溶性膳食纤维多含有纤维素结晶体。如图3所示,4种不同颗粒粒径的LIDF衍射角2θ在15°、22.5°附近有结晶纤维素I的特征衍射峰,表明LIDF具有结晶纤维素I型结晶结构,其中包含有纤维素的结晶区域和由非结晶纤维素、半纤维素和木质素组成的无定形区[4,19],与红外光谱的分析结果相似。不同颗粒粒径LIDF的X衍射图中衍射峰的峰值位置和宽度基本不变,表明在研究的颗粒粒径区间范围内LIDF的纤维素晶型未发生变化,同为结晶纤维素I型。不同的是随着颗粒粒径的减小,各衍射峰的高度和强度有所变化,通过Segal的公式计算出LIDF-A、LIDF-B、LIDF-C、LIDF-D的结晶度指数分别为22.25%、20.98%、19.40%、17.02%。表明粉碎粒径降低了不溶性膳食纤维中纤维素的结晶度,这与Ullah[21]对不同粒径的豆渣不溶性膳食纤维研究结果相似。可能因为在干法粉碎剪切作用下颗粒粒径越小,纤维结构更加松散,更多的结晶区暴露出来,晶区更易于发生破裂。Lin[22]的研究表明,纤维素的结晶度越高,其抗拉伸强度和硬度越高,其柔软度、吸湿和溶胀性等指标越低。故4种不同颗粒粒径的LIDF结晶度指数不同可能直接影响LIDF的物理特性。

图3 LIDF的X衍射图Fig.3 X-ray diffraction diagrams of LIDF

2.3 LIDF的功能成分含量

从表3可知,4种不同颗粒粒径的LIDF中不溶性膳食纤维含量在69%~74%之间,表明荷叶粉在常规提取过程中非纤维成分酶解不完全,与Ma[3]的研究结果相似。颗粒粒径较大两组(LIDF-A与LIDF-B)的不溶性膳食纤维含量显著高于颗粒粒径较小的两组(LIDF-C与LIDF-D)(P<0.05)。结合颗粒粒径分布和显微结构观察,与LIDF-C和LIDF-D相比,LIDF-A和LIDF-B破碎程度较低,可观察到的荷叶叶肉相对较多,在提取过程中更易于出现非纤维类组分酶解不充分导致不溶性膳食纤维的含量较低。黄酮、多酚类化合物具有较好的抗氧化性,可通过氢键、疏水相互作用、共价键或物理夹带等方式与膳食纤维联接从而到达肠道通过发挥抗氧化作用[23]。从表3可知随着LIDF颗粒粒径的减小其总黄酮、总多酚含量逐渐减小,颗粒粒径较大两组(LIDF-A与LIDF-B)的总黄酮、总多酚含量与颗粒粒径较小两组(LIDF-C与LIDF-D)含量差异更为明显。荷叶粉的颗粒粒径越小,提取过程中颗粒与提取液接触越充分,可溶性的黄酮、多酚类化合物越易于溶出。

表3 LIDF的功能成分含量

2.4 LIDF体外吸附特性

如图4~7所示,在研究的颗粒粒径范围内,LIDF体外吸附特性随着颗粒粒径的减小先增高后降低。LIDF-B的持油力、持水力相对较高,分别为6.28、5.22 g/g。LIDF-C的阳离子交换能力为0.172 mmol/g,pH=2条件下对胆固醇的吸附能力为13.41 mg/g,pH=7条件下对胆固醇的吸附能力为49.74 mg/g,对胆酸钠的吸附能力为90.95 mg/g,对葡萄糖的吸附能力为6.80 mmol/g,与其他三组相比相对较高。有研究表明,膳食纤维体外吸附特性与颗粒的比表面积、纤维分子结构、粉体微观结构以及纤维结晶度等因素相关[4,24,25]。结合粒径分布、扫描电镜、傅里叶红外光谱及X衍射光谱结果分析,当LIDF颗粒粒径减小时,比表面积增加,物理吸附能力增强;
纤维结晶度降低,纤维结构从致密转变为相对松散,使得内部空隙增加,物理截留能力增强;
同时纤维分子中的羟基、氨基、羧基等相关吸附基团暴露更多[24],也利于增强对水分、阳离子等的吸附能力。而膳食纤维颗粒粒径过小,又可能导致膳食纤维的网络结构过度破碎使得吸附能力降低[13,25]。结果表明,LIDF-B、LIDF-C的体外吸附特性相对较佳,LIDF颗粒粒径过大或过小都不利于LIDF的体外吸附特性。

图4 LIDF的持水力和持油力 Fig.4 Water retention and oil retention of LIDF

图5 LIDF的阳离子交换能力Fig.5 Cation exchange capacity of LIDF

图6 LIDF对胆固醇、胆酸钠的吸附能力 Fig.6 Adsorption capacity of LIDF to cholesterol and sodium cholate

图7 LIDF对葡萄糖的吸附能力Fig.7 Adsorption capacity of LIDF to glucose

2.5 LIDF感官品质

2.5.1 色度

从表4可知,在研究的颗粒粒径范围内,随着颗粒粒径的减小LIDF粉体L*值(亮度)先增加后降低,a*值(红色)和b*值(黄色)增加,与Jiang[26]、Ikram[27]研究结果相似。颗粒粒径减小利于粉体混合均匀度增加,L*值(亮度)增高[26];
同时颗粒粒径减小导致比表面积增大,粉体易与反应物接触发生酶解或非酶反应产生深褐色产物使L*值(亮度)降低[27]。在本研究中,LIDF-D的L*值(亮度)虽低于LIDF-C,但两者无显著性差异。LIDF粉体a*值(红色)增加可能与粒径越小越易与反应物接触发生酶解或非酶反应产生深褐色产物使LIDF偏红相关[27]。LIDF粉体b*值(黄色)增加可能与粒径减小有利于酚类化合物发生聚集有关[26],在本研究中LIDF-B的b*值(黄色)虽略高于LIDF-C,但两者无显著性差异。

2.5.2 LIDF食品感官品质

如表5所示,在研究的颗粒粒径范围内,随着颗粒粒径减小LIDF饮料、米糊产品感官评分增加,LIDF饼干产品感官评分无显著性差异。荷叶作为食品辅料开发的难点主要集中在纤维口感粗糙以及荷叶单宁、槲皮素和生物碱等成分引起的苦涩味[28]两方面。结合LIDF粒径分布、扫描电镜、傅里叶红外光谱及X衍射光谱结果分析,颗粒粒径减小可引起纤维结晶度降低,纤维结构相对松散,从而降低食用口感的粗糙度;
同时颗粒粒径越小,提取过程中荷叶苦味成分越易于溶出,保留在LIDF中的苦味成分减小,产品的苦涩味降低。总体而言,在研究的颗粒粒径范围内LIDF-C与LIDF-D感官评分相对较高。

表4 LIDF色泽

表5 LIDF食品感官评分

荷叶富含多酚类物质和膳食纤维,符合天然优质膳食纤维的来源条件,具有较好的开发潜力。本试验通过对比分析4种不同颗粒粒径LIDF的结构、理化特性和食用感官品质,筛选出LIDF作为高纤维食品辅料开发的最佳粒径。荷叶经淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解制备LIDF,显微结构表明LIDF表面出现孔洞,随着颗粒粒径减小,荷叶内质网格状纤维暴露程度增加。光谱分析表明LIDF具有纤维素I型结晶结构,颗粒粒径减小不引起LIDF分子结构的变化,可降低纤维素结晶度指数。随着颗粒粒径减小,LIDF总黄酮、总多酚含量降低,不溶性膳食纤维含量增加,颗粒粒径较大两组(LIDF-A与LIDF-B)与颗粒粒径较小的两组(LIDF-C与LIDF-D)含量差异更为明显。随着颗粒粒径减小,LIDF的体外吸附特性升高后降低,LIDF-B、LIDF-C的体外吸附特性相对较佳,LIDF颗粒粒径过大或过小都不利于LIDF的体外吸附特性。LIDF粉体a*值(红色)、b*值(黄色)及其产品感官评分随颗粒粒径减小而增高。本试验结合考虑评价出LIDF-C(D5058.35 μm)作为高纤维功能食品辅料的开发潜力较好,为荷叶膳食纤维功能性的深入研究提供理论依据。

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