付亚男，曾凤，饶晶晶，黄艳萍，刘志新，刘龙
截至2022年5月25日，新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）共造成5亿多人患病，600多万人死亡［1］。SARSCoV-2与SARS-CoV同属β冠状病毒属，基因组序列相似，均编码刺突蛋白（spike protein，S）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）、膜蛋白（membrane protein，M）、包膜蛋白（envelope protein，E）、16种非结构蛋白及多种辅助蛋白。SARS-CoV-2与SARSCoV具有较高的序列同源性和蛋白质-蛋白质相互作用相似性［2］，但SARS-CoV-2和SARS-CoV的辅助蛋白ORF8具有较低的蛋白质序列同源性：核苷酸同源性为55.4%，蛋白质同源性为30%［3］。SARSCoV-2辅助蛋白在病毒生命周期和毒力强弱中发挥着重要作用，辅助蛋白ORF8与病毒复制无关，但能够与宿主分子直接相互作用，提高了病毒感染的可能性［2］。目前，SARS-CoV-2辅助蛋白正快速进化及突变，可能会造成病毒毒力及传播性的增加，而通过研究病毒辅助蛋白可为临床诊断新型冠状病毒肺炎（COVID-19）提供新的途径及治疗药物。本文主要归纳总结了SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8的突变及功能，旨在为临床治疗COVID-19提供相关线索及理论支持。
1.1 ORF8的结构SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8的晶体结构为共价二聚体，ORF8单体结构是由β1～β8形成反向平行的β折叠；
ORF8二级结构由1个短的α-螺旋、7个β-链和1个未知的外部结构域组成［4］。SARS-CoV-2 ORF8属于免疫球蛋白（Ig）新家族，由N端序列和Ig样折叠组成，是含有121个氨基酸的分泌蛋白，定位并富集于内质网（endoplasmic reticulum，ER）［5］。经多重比对和结构分析表明，SARS-CoV-2 ORF8与SARS-CoV ORF8蛋白是不同的新型病毒蛋白，两者具有较低的序列相似性与结构同源性［6-7］。
1.2 ORF8的功能SARS-CoV-2通过结合血管紧张素转换酶2（ACE2）受体进入细胞后，基因组序列编码的开放阅读框翻译为不同的病毒蛋白，其中辅助蛋白在抵御宿主免疫反应过程中发挥了重要作用。机体在抵抗SARS-CoV-2感染的过程中涉及多条抗病毒信号通路，其中以Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferon，IFN-Ⅰ）通路与核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路为主。IFN-Ⅰ和NF-κB通路主要通过诱导IFN-Ⅰ及炎性细胞因子的释放来抵抗病毒感染。SARS-CoV-2 ORF8介导IFN-Ⅰ通路的抑制及NF-κB通路的激活，在抑制宿主免疫反应中起重要作用。（1）SARS-CoV-2 ORF8能够抑制IFN-Ⅰ通路。①ORF8可以通过抑制干扰素刺激反应元件（interferon stimulus response element，ISRE）的产生与减少干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的核转位来抑制干扰素的产生［8-9］。②ORF8下调聚肌苷酸胞苷酸（polynosinlc acidpolycyttdylic acld，Poly I:C）诱导的IFN-β和干扰素刺激基因（interferon-stimulating genes，ISGs）表达［10］。③ORF8蛋白通过激活转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇依赖酶1（inositolrequiring enzyme 1，IRE1）通路诱导内质网应激（ERS），ERS通路的激活在介导IFN-β产生方面具有重要的免疫调节作用［10］。然而，ERS通路的激活如何影响IFN-β和ISGs表达的详细机制仍有待阐 明。（2）SARS-CoV-2感 染细胞 后，辅 助 蛋白ORF8在内质网直接与主要组织相容性复合体Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）分子相结合，促进MHCⅠ运输到自噬体，随后ORF8与自噬基因Beclin1相互作用，启动自噬溶酶体降解，MHCⅠ的降解减少了其与CD8+T细胞的结合，介导SARS-CoV-2逃避CD8+T细胞的杀伤作用［11］。（3）SARS-CoV-2 ORF8通过与宿主重组白细胞介素17受体A（interleukin 17 receptor A，IL-17RA）相互作用激活白细胞介素17（interleukin 17，IL-17）信号通路来促进促炎因子表达，然后ORF8与IL-17RA结合募集NF-κB激活剂1（Act1），Act1可以与肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）结合激活NF-κB通路，导致大量炎性因子释放［12］。同时IL-17抗体能够通过抑制ORF8与IL-17RA的相互作用来控制细胞因子风暴，为治疗COVID-19提供潜在靶点［13］。SARS-CoV-2在早期感染阶段逃避宿主抗病毒免疫反应的机制见图1。
1.3 SARS-CoV-2与SARS-CoV ORF8的 功 能 比较SARS-CoV ORF8是一种ER驻留膜蛋白［14］。在SARS-CoV流行的中晚期，ORF8蛋白伴随着29个核苷酸（nucleotides，nt）缺失，导致ORF8a和ORF8b两种截短功能蛋白的产生，SARS-CoV ORF8的29 nt缺失减弱了病毒的复制［15］。ORF8a和ORF8b分别编码39个和84个残基多肽，ORF8a的氨基酸个数太少，因此不能发挥信号功能；
ORF8b蛋白极其不稳定，会迅速降解［16］。ORF8ab通过诱导ATF6蛋白水解和加工的N端的核易位来调节未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）［14］。ORF8ab的N81是其N-连接糖基化位点，糖基化对蛋白质的寡聚化、分选、运输和折叠起重要作用［17］。未糖基化的ORF8ab是不稳定的，这解释了在没有ORF8a区域的情况下，ORF8b会迅速降解，并推测糖基化有助于ORF8b的折叠［18］。SARS-CoV辅助蛋白ORF8b和ORF8ab以泛素-蛋白酶体依赖性方式诱导IRF3的降解，从而导致IRF3二聚化减少，最终抑制IFN-β信号通路［19］。ORF8b区域可能包含多个功能域来发挥功能，如泛素结合、泛素化和糖基化等，从而参与ORF8ab稳定性、宿主-病毒相互作用和生化特性的调节［18］。然而，迄今为止尚未在ORF8a区域中鉴定出功能域，但ORF8a可以通过线粒体依赖性途径诱导细胞凋亡［20］。这表明沉默蛋白ORF8ab的表达可能是靶向SARS-CoV逃避宿主防御机制的策略［14］。
Fig.1 Diagram of the mechanism of SARS-CoV-2 ORF8 escaping host antiviral immune response图1 SARS-CoV-2 ORF8逃避宿主抗病毒免疫反应机制图
2.1 ORF8截短突变SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8具有快速进化的特性，且正在经历快速的非随机进化［21］。2020年1月23日—3月25日，新加坡和中国台湾收集的191个临床样本中有23.6%存在ORF8 382 nt的缺失，表明该缺失突变体保留了在人与人之间有效感染及传播的能力［7］。该突变体导致了ORF8/ORF7b的缺失，其与较轻的症状和较低的病毒复制能力有关［22］。SARS-CoV-2 ORF8缺失突变体会影响蛋白质的转录调控，如5′端336 nt缺失消除了ORF8转录调控序列［23］。2020年12月发现的ORF8 Q27stop突变体可能改变了病毒的传播能力，基因组中大多数刺突蛋白的突变与ORF8 Q27stop和ORF8 K68stop相关，表明监测ORF8的缺陷谱系对了解COVID-19的流行至关重要［24］。目前，SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8缺失突变体仍在继续进化，且将有可能进化为另一进化枝，这一发现将有助于了解SARS-CoV-2的传播及进化动态。
2.2 ORF8点 突 变SARS-CoV-2 ORF8第84位 氨基酸为亮氨酸或丝氨酸，因此具有ORF8L和ORF8S两种核苷酸序列［25］。研究者从6 337个核苷酸序列中鉴定出240个SARS-CoV-2 ORF8的非同义突变，其中7%是无义突变，93%是错义突变，在这些突变体中，L84S为最主要的突变［26］。L84S突变通常会伴随V62L突变，V62L和S24L突变可能具有临床意义［27］。SARS-CoV-2 ORF8突变体导致该病毒在传染性、致病性和免疫逃逸方面存在显着差异，其原因可能是病毒突变体增强了病毒逃避宿主免疫系统的能力，ORF8 L84S突变体不能像野生型抗原肽一样与MHCⅡ等位基因抗原结合槽结合，从而产生逃避宿主细胞免疫反应的能力［28］。特别是W45L突变体，能够增加其与IRF3的结合亲和力来帮助病毒逃避免疫系统［9］，表明ORF8突变体可能会进一步逃避宿主免疫监视。S24L是ORF8中第二大常见的突变，其可以增加ORF8蛋白的折叠稳定性，并与SARS-CoV-2的传播有关［29-30］。因此，SARS-CoV-2ORF8突变体的出现可能与病毒免疫逃逸和毒力增强有关。
3.1 ORF8抗体在血清学检测和诊断中的应用前景SARS-CoV-2以高毒力、高传染性为特征，常用的检测方法多为血清学检测［31］。SARS-CoV-2ORF8具有分泌性而被表征为新型免疫原性分泌蛋白，在COVID-19患者的血清中能够检测到ORF8抗体。研究发现ORF8抗体的产生早于N蛋白抗体，抗ORF8抗体的检测比传统的抗N抗体检测更灵敏和准确，通过ELISA分析表明，ORF8在COVID-19患者的抗体反应方面具有高度免疫原性［6］。据此，SARS-CoV-2 ORF8抗体可以用来进行血清学检测和诊断，同时也为疫苗开发提供了依据。
3.2 ORF8在药物治疗中的应用前景SARS-CoV-2 ORF8作为拮抗宿主天然免疫反应的重要蛋白，通过抑制ORF8来改善病毒的免疫逃逸和病毒感染可能是一种有效的治疗策略。通过鉴定高可信度的SARS-CoV-2蛋白质-宿主蛋白质相互作用网络，研究人员确定了69种相互作用物，其中66种可以用于药物研究，并发现47种人类蛋白质与SARS-CoV-2辅助蛋白ORF8相互作用；
其中有15种是处于临床前、临床试验或已获得美国食品和药物管理局（FDA）批准的已知药物靶点［32］。从灌木叶中分离出的化合物具有作为免疫调节剂的潜力，这些化合物能够与SARS-CoV-2 ORF8 mRNA的翻译起始位点及翻译终止位点结合，从而抑制与COVID-19感染有关的细胞因子风暴，因此建议进一步研究灌木叶分离出的化合物的免疫调节特性及ORF8蛋白在COVID-19感染药物开发中的作用［33］。另外，ORF8可以激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（P13K/Akt/mTOR）信号通路以维持病毒增殖的环境；
雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的抑制剂［3］，通过雷帕霉素抑制mTORC1的活性来阻断细胞生长途径可能是抵抗病毒感染的治疗策略。
SARS-CoV-2 ORF8不 仅 对COVID-19的 发 病机制和免疫调节具有重要作用，而且对于药物和诊断试剂的开发也很重要。SARS-CoV-2 ORF8抗体较N抗体具有较高的灵敏度和准确性而被提议用作血清学检测和诊断COVID-19的标志物［6］。但ORF8较高的突变性和进化性可能会影响血清学反应和作为治疗靶点的可行性［3］。目前已经有研究报道，ORF8中的突变体能够增加其与IRF3的结合亲和力，从而帮助病毒逃避宿主免疫系统［9］。因此这种高突变性及高进化性很有可能会加重病毒对人体的感染及在宿主体内的复制。目前尚不清楚ORF8变异是否会影响抗原表位的变化，因此必须研究SARS-CoV-2 ORF8的各种自然变异对检测及诊断COVID-19的潜在影响。
同时，SARS-CoV-2 ORF8蛋白通过影响宿主各种免疫途径来逃避免疫监视，研究其背后的分子机制将增进对ORF8在COVID-19发病机制中作用的认识，有助于开发有效的抗病毒药物。今后需要进一步揭示SARS-CoV-2 ORF8高频突变的重要性及其对宿主免疫应答相关的影响，这将有利于SARSCoV-2的溯源工作。
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