朱桓奕，罗亮，张璇，李照伟，浦同灿，王慧，曾红，杨晓伟，刘霞，赵光伟
（1.西南大学动物医学院，重庆 402460；
2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 550008；
3.贵阳市花溪区动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 550025）
猪圆环病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、增生性坏死性间质性肺炎、仔猪先天性震颤以及妊娠母猪生殖功能紊乱等多种病症[1]，在我国不同规模的猪场均有感染[2-3]。刚地弓形虫（Toxoplasma gondii），简称弓形虫，其终末宿主是猫，多种哺乳动物、鸟类、爬行动物以及人类是其中间宿主，可造成流产、产死胎、胎儿先天畸形等[4]。鉴于PCV2 和弓形虫导致的临床症状往往不典型或不显著，在猪场中时有混合感染的报道[5-6]，本试验拟通过构建双重PCR 检测方法，实现对PCV2 和弓形虫的同步检测，以期为实验室病原的快速检测以及养殖场的流行病学调查和综合防控提供技术支撑。
1.1 材料
1.1.1 病料 感染PCV2、伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、弓形虫（Toxoplasma gondii）RH 株速殖子的阳性病料，均由西南大学动物疾病诊断中心实验室保存。
1.1.2 临床样本 采集四川省和重庆市22 个猪养殖场的血清、脾脏样本，共63 份。
1.1.3 主要试剂 Easy Pure Viral DNA/RNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司；
rTaqDNA 聚合酶预混液、DL 2 000 DNA Marker，购自TaKaRa公司；
HiScript ⅡSuperMix for qPCR 反转录试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.1.4 引物 根据GenBank 中PCV2（登录号OL438912.1）Cap基因保守序列和弓形虫标准虫株（RH 株）529序列，利用Primer 5.0 软件设计2对特异性引物（表1），送至华大基因重庆分公司合成。
表1 特异性引物序列
1.2 方法
1.2.1 核酸提取 按照Easy Pure Viral DNA/RNA Kit 操作说明书分别提取PCV2、PPV、PRV 阳性病料、弓形虫RH 株速殖子和临床样本的DNA，PRRSV、CSFV 等阳性病料的RNA，反转录为cDNA。利用紫外分光光度计测量核酸浓度，-80 ℃保存备用。
1.2.2 单一PCR 反应退火温度优化 设置梯度退火温度程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s、梯度退火温度（49、50、51、52、53、54、55 ℃）30 s、72 ℃延伸30 s，35 个循环；
72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，确定最佳退火温度。
1.2.3 单一PCR 反应引物浓度筛选 PCV2 和弓形虫的原始引物浓度均为10.00 μmol/L，分别以ddH2O 进行2 倍连续稀释，共7 个稀释度。以最佳退火温度进行扩增，筛选最佳引物浓度。
1.2.4 单一PCR 反应灵敏度试验 经测量，PCV2 的原始核酸质量浓度为625.30 μg/mL，弓形虫的原始核酸质量浓度为467.00 μg/mL。分别以ddH2O 对2 种核酸模板进行2 倍连续稀释，共7 个稀释度。以最佳退火温度和最佳引物浓度进行扩增，检测单一方法的灵敏度。
1.2.5 双重PCR 反应体系建立 在单一PCR 反应的基础上，对双重PCR 方法梯度退火温度进行优化。反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s、梯度退火温度（52、53、54、55、56、57、58 ℃）30 s、72 ℃延伸30 s，35 个循环；
72 ℃延伸10 min。选择扩增效率最高的温度作为最佳退火温度。
1.2.6 双重PCR 反应灵敏性试验 将PCV2 和弓形虫核酸混合，用ddH2O 连续进行2 倍稀释，共5个梯度，检测双重PCR 方法的灵敏性。
1.2.7 双重PCR 反应特异性试验 用优化后的双重PCR 体系及程序，分别以PCV2、弓形虫、PPV、PRV、CSFV 和PRRSV 核酸为模板，进行特异性试验，检验双重PCR 方法的特异性。
1.2.8 临床样本检测 分别利用双重PCR 方法和单一PCR 方法对来自四川省和重庆市22 个猪场的63 份临床样本进行检测，计算两种方法的符合率。
2.1 单一PCR 方法
2.1.1 退火温度优化 结果显示，PCV2 在退火温度49～55 ℃范围内均可被有效扩增，在51～54 ℃时扩增效率最佳（图1-A）；
弓形虫退火温度在49～53 ℃范围内均可被有效扩增，在51～53 ℃范围内扩增效率最佳（图1-B）。
2.1.2 引物浓度筛选 结果显示，PCV2 有效扩增的引物浓度范围为0.63～10.00 μmol/L，在2.50 μmol/L时扩增效果最佳（图2-A）；
弓形虫有效扩增的引物浓度范围为0.16～10.00 μmol/L，在0.31 μmol/L时扩增效果最高且杂带干扰较少（图2-B）。
图1 单一PCR 反应退火温度优化结果
图2 单一PCR 反应引物浓度优化结果
2.1.3 灵敏性试验 结果显示，PCV2 的最低检测限为9.77 μg/mL（图3-A），弓形虫的最低检测限为29.19 μg/mL（图3-B）。
图3 单一PCR 反应灵敏性试验结果
2.2 双重PCR 方法
2.2.1 退火温度优化 结果（图4）显示，退火温度在52～58 ℃范围内均能对PCV2 和弓形虫进行有效扩增。结合单一PCR 扩增时二者在不同退火温度时的扩增效率，将53 ℃作为双重PCR 方法的最佳退火温度。
2.2.2 灵敏性试验 结果（图5）显示，双重PCR 方法对PCV2 的最低检测限为78.16 μg/mL，对弓形虫的最低检测限为29.19 μg/mL。
图5 双重PCR 方法灵敏性试验结果
2.2.3 特异性试验 分别以PCV2、弓形虫、PRV、PPV、PRRSV、CSFV 核酸为模板进行扩增。结果（图6）显示，只有PCV2 和弓形虫扩增出大小为413 和529 bp 的目的条带，其他病原均无条带扩增，说明该方法特异性良好。
图6 双重PCR 方法特异性试验结果
2.3 临床样本检测
利用建立的双重PCR 方法和单一PCR 方法分别对来自四川省和重庆市的63 份临床样品进行检测。结果显示，双重PCR 方法共检测出8 份PCV2阳性样本，阳性率为12.7%，弓形虫均为阴性；
与单重PCR 方法完全一致，两者的符合率为100%。
多重PCR 反应是在同一PCR 反应体系里加入2 对及以上引物，可同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应。多种病原体在同一反应管内被同时检出，不仅大大节约了检测所需时间，同时也节省了试剂，使检测成本显著下降，具备高效、经济简便和准确等优点[7-8]，已被广泛应用于兽医临床上多种病原的检测。近几年有关猪弓形虫与PCV2 混合感染的报道不断增加，因此本研究聚焦两种生猪养殖中较为常见的病原建立双重PCR 检测方法，具有广阔的应用前景。引物的设计对多重PCR 反应的扩增效率和特异性至关重要。在设计引物时，使PCV2 和弓形虫二者的片段大小相差100 bp 以上，便于电泳时识别；
同时将2 对引物的Tm 值设计的较为相近，也便于双重PCR 方法的建立。
灵敏性试验结果显示，单一PCR 方法中PCV2 和弓形虫的最低检出限分别为9.77和29.19μg/mL，双重PCR方法中分别为78.16和29.19μg/mL，双重方法对PCV2的检测灵敏度稍低，但在后续临床样本的检测中，两种方法的符合率为100%。主要原因是从临床样本中提取的核酸浓度往往较高，足以满足扩增需求，说明本试验建立的双重PCR 方法灵敏性能够满足临床要求。特异性试验结果显示，双重PCR 方法对PRV、PPV、PRRSV、CSFV 等病原均不会产生扩增条带，说明特异性较好。临床样本检测结果显示，PCV2 在川渝地区部分猪场的感染率较高（阳性率12.7%），这与江地科等[9]报道的2016—2017 年四川省PCV2 的感染率相差不大（16.04%），而本次试验未检测到弓形虫，可能是弓形虫在上述区域的感染并不严重。
综上所述，本研究建立了一种快速、特异、灵敏检测PCV2 与弓形虫的双重PCR 检测方法，为实验室病原的快速确诊以及养殖场的流行病学调查和综合防控提供了技术支撑。
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