梁 峰，张 玮，王胜杰，武雪亮，岳 磊，张迎春，*
(1．河北北方学院附属第一医院普通外科，河北张家口 075000；
2．河北北方学院附属第一医院小儿外科，河北 张家口075000)
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是中国常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升和年轻化趋势[1]。尽管结直肠癌的诊断与治疗已经取得了显著进步，但其疗效及预后仍不容乐观[2]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指长度大于200 nt的非编码RNA，其在表观遗传调控、转录及转录后调控等生物学过程中发挥重要作用，广泛参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等多种生物学过程，这为肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供了新的研究方向[3-6]。LncRNA RUNX1-IT1是新发现的一种非编码RNA，关于lncRNA RUNX1-IT1在恶性肿瘤中的报道[7]不多，且经IntaRNA 2.0软件分析预测miR-21为lncRNA RUNX1-IT1作用靶点，但lncRNA RUNX1-IT1/miR-21调控轴对结直肠癌细胞的作用未见报道。基于此，本研究探讨lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织和人结直肠癌细胞系中的表达情况，并分析其对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响及其与miR-21的调控关系，以期为结直肠癌的临床诊断和治疗提供参考。
1.1 研究对象
选取2017年1月—2019年1月于河北北方学院附属第一医院接受根治性手术切除的结直肠癌组织标本62例及其相应的癌旁正常组织标本(距离癌组织边缘＞5 cm)62例。结直肠癌患者发病年龄在37～86岁，男37例，女25例；
其中结肠癌患者33例，直肠癌患者29例。所有纳入患者的临床资料均完整，本研究经医院伦理委员会批准(2021177)，所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。纳入标准：①术后病理确诊为结直肠癌；
②患者术前未接受过介入、放化疗及免疫治疗；
③既往无其他肿瘤病史。排除标准：①伴有严重心、肝、肾功能异常者；
②伴有其他恶性肿瘤；
③术前行放化疗或免疫治疗等的患者。
1.2 细胞与试剂
人结直肠癌细胞系(SW480、SW620、HCT-116)和人正常结直肠上皮细胞系(FHC)均购自北纳生物。RPMI-1640和DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，双荧光素酶报告基因系统购自美国Promega公司，TRIzol试剂盒、LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，SYBR qPCR Master Mix和逆转录试剂盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit)购自宝生物工程(大连)有限公司。
RUNX1-IT1过表达质粒(pcDNA-RUNX1-IT1)及阴性对照质粒(pcDNA-control)，miR-21抑制(anti-miR-21)及阴性对照(anti-miR-con)、miR-21过表达(miR-21 mimic)及阴性对照(mimic-NC)序列均由吉满生物科技有限公司设计合成。
1.3 细胞培养与转染
FHC细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，结直肠癌SW480、SW620和HCT116细胞用含有10%胎牛血清RPMI-1640培养液培养，分别放置在37℃、CO2体积分数为5%恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。将SW480细胞以1×105个/孔接种至6孔培养板进行培养，待细胞生长至80%左右进行细胞转染，SW480细胞转染前1 h更换为Opti-MEM减血清培养基，转染分为过表达(pcDNAcontrol、pcDNA-RUNX1-IT1)和抑制表达(pcDNARUNX1-IT1、pcDNA-RUNX1-IT1+anti-miR-con、pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21)两种方案分组；
按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染操作，转染6 h后更换为含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，继续培养48 h后检测过表达/干扰效果。
1.4 实时荧光定量PCR检测RUNX1-IT1在结直肠癌及癌旁组织中的表达
使用TRIzol试剂提取组织总RNA，超微量紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以1 μL cDNA为模板，按照实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)试剂盒说明书进行PCR扩增。反应条件：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸90 s，40个循环；
最后72℃延伸5 min。以GAPDH和U6作为内参，采用2-ΔΔCT法计算RUNX1-IT1和miR-21的相对表达。引物序列如下：RUNX1-IT1上 游 引 物，5′-CCTACTTCTGCACGATGTGA TG-3′，下游引物，5′-CCTTTGCTACGGTTGGTTACA TT-3′；
miR-21上游引物，5′-TTGAATTCTAACACC TTCGTGGCTACAGAG-3′，下游引物，5′-TTAGATC TCATTTATCGAGGGAAGGATTG-3′。
1.5 双荧光素酶报告实验
采用IntaRNA 2.0(http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/Input.jsp)软件预测RUNX1-IT1与miR-21间的靶向结合序列，分别设计合成RUNX1-IT1的野生型(WT)和突变型(MUT)结合位点序列并整合至pGL3载体构建报告基因质粒(RUNX1-IT1-WT和RUNX1-IT1-MUT)，并将其加载到pMIR-GLO™荧光素酶载体中。将SW480细胞以1×105个/孔接种在12孔板中培养，并通过Lipofectamine 2000将含有RUNX1-IT1-WT或RUNX1-IT1-MUT和miR-21 mimic以 及miRNC的载体转染到SW480细胞中。转染48 h后，再根据双荧光素酶报告系统试剂盒说明书进行萤火虫荧光素酶活性检测。
1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力
1.6.1 迁移实验收集转染后培养至对数生长期的SW480细胞，在Transwell上层小室加入稀释后的SW480细胞(1×l06个/mL)，下室加入含10% FBS的细胞培养液，37℃培养24 h，取出上室，去除上层小室未迁移的细胞，用70%甲醛固定30 min，结晶紫染色拍照，显微镜下计数穿膜细胞数。
1.6.2 侵袭实验将-20℃取出的Matrigel置4℃冰箱过夜液化，4℃无血清培养基按1∶5比例稀释Matrigel后，取100 μL加入到Transwell小室中，37℃使其凝固，按照迁移实验进行后续操作。
1.7 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，符合正态分布且方差齐性的计量资料以xˉ±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差及两两比较LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。lncRNA RUNX1-IT1和miR-21在结直肠癌组织中表达的相关性采用Pearson检验分析。
2.1 RUNX1-IT1和miR-21在结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中的表达情况
qPCR检测结果表明lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织中的相对表达水平(3.323±0.150)显著低于癌旁组织(4.372±0.166)；
miR-21在结直肠癌组织中的相对表达水平(3.839±0.160)显著高于癌旁组织(3.052±0.141)，差异均具有统计学意义(均为P＜0.01，图1A和B)。LncRNA RUNX1-IT1和miR-21在结直肠癌组织中的表达呈负相关(r=-0.275，P=0.031，图1C)。此外，lncRNA RUNX1-IT1在3种结直肠癌细胞系(SW480、SW620、HCT-116)中的表达水平均显著低于正常结直肠FHC细胞(均为P＜0.05，图1D)，而miR-21在上述3种结直肠癌细胞系中的表达水平明显高于FHC细胞(均为P＜0.05，图1E)，SW480细胞最明显，故后续细胞系实验均采用SW480细胞。上述结果也表明lncRNA RUNX1-IT1低表达和miR-21高表达可能参与结直肠癌的发生发展。
图1 RUNX1-IT1和miR-21在结直肠癌组织和细胞系中的表达
2.2 上调lncRNA RUNX1-IT1表达抑制SW480细胞的侵袭和迁移能力
与转染pcDNA-control对照组相比，转染pcDNARUNX1-IT1质粒组SW480细胞中lncRNA RUNX1-IT1表达水平明显升高(t=6.347，P=0.003)，见图2A。Transwell侵袭和迁移实验结果显示，转染pcDNARUNX1-IT1质粒组的侵袭细胞数和迁移细胞数均明显少于转染对照组(侵袭实验：t=12.49，P＜0.01；
迁移实验：t=5.764，P=0.005)，见图2B。结果表明上调lncRNA RUNX1-IT1的表达可抑制SW480细胞侵袭和迁移能力。
图2 上调RUNX1-IT1表达对SW480细胞侵袭和迁移能力的影响
2.3 lncRNA RUNX1-IT1和miR-21间 存 在 靶 向关系
通过IntaRNA 2.0预测到lncRNA RUNX1-IT1与miR-21之间存在靶向结合位点(图3A)。双荧光素酶报告实验结果显示，与转染mimic阴性对照组相比，转染miR-21 mimic即过表达miR-21组lncRNA RUNX1-IT1 WT(野生型)的荧光素酶活性显著下降(P＜0.05)，而lncRNA RUNX1-IT1 MUT(突变型)荧光素酶活性无明显变化(图3B)。qPCR检测结果表明，与转染pcDNAcontrol组(1.003±0.095)相比，在转染pcDNA-RUNX1-IT1质粒后，miR-21表达水平在SW480细胞中的明显下降(0.293±0.020)，差异具有统计学意义(t=7.289，P=0.002)。上述结果表明miR-21能够靶向结合lncRNA RUNX1-IT1。
图3 双荧光素酶报告实验验证lncRNA RUNX1-IT1与miR-21间的靶向关系
2.4 抑制miR-21表达可抑制SW480细胞的侵袭和迁移能力
qPCR检测结果显示，与转染anti-miR-con对照组相比，转染anti-miR-21组后SW480细胞中miR-21表达 水 平 显 著 降 低(t=6.80，P=0.002)，见 图4A。Transwell侵袭和迁移实验结果显示，anti-miR-21组的侵袭和迁移细胞数均明显低于对照组(侵袭实验：t=16.360，P＜0.01；
迁移实验：t=7.096，P=0.002)，见图4B，表明miR-21表达下调可抑制SW480细胞的侵袭和迁移能力。
图4 下调miR-21表达对SW480细胞侵袭和迁移能力的影响
2.5 过表达miR-21逆转RUNX1-IT1对SW480细胞侵袭和迁移能力的抑制作用
qPCR检测结果(图5A)显示，与转染miR-con对照组比较，转染miR-21过表达组SW480细胞中miR-21表达水平显著升高(t=12.01，P＜0.01)。为确认lncRNA RUNX1-IT1是否通过miR-21调控SW480细胞的侵袭和迁移，我们上调RUNX1-IT1的表达同时过表达miR-21。结果(图5B)显示，与转染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-con相比，共转染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21组中细胞侵袭和迁移细胞数均显著升高(均为P＜0.05)(侵袭实验：t=23.860，P＜0.01；
迁移实验：t=11.020，P＜0.01)。上述结果表明过表达miR-21可逆转lncRNA RUNX1-IT1表达上调对SW480细胞侵袭和迁移能力的抑制作用。
图5 过表达miR-21逆转RUNX1-IT1对SW480细胞侵袭和迁移能力的抑制作用
结直肠癌早期症状隐匿，患者就诊时大多处于中晚期，治疗难度较大，尽管结直肠癌的诊断与治疗已经取得了显著进步，但其疗效及预后仍不容乐观[8-10]。因此，探寻可靠的生物标志物对于结直肠癌患者的早期诊断、治疗以及改善预后至关重要[11]。越来越多的证据表明，lncRNA异常表达与肿瘤发生、进展和预后不良有关，可作为肿瘤早期诊断的新型生物标志物[12-13]。
LncRNA RUNX1-IT1是转录因子RUNX1的内含子转录本，也称为21号染色体开放阅读框96(C21orF96)。尽管RUNX1的功能已在不同疾病中得到证实，但lncRNA RUNX1-IT1在多种肿瘤中的功能及其潜在机制仍不清楚[14]。有关LncRNA RUNX1-IT1在肿瘤中的相关研究报道不多，并且研究结论存在不一致情况。lncRNARUNX1-IT1在子宫内膜癌中表达下调，并通过抑制miR-21表达来抑制癌细胞的增殖[15]。过表达lncRNA RUNX1-IT1可显著抑制肺癌细胞增殖、克隆形成和侵袭能力，而lncRNA RUNX1-IT1的敲除则产生相反的效果[16]。Shi等[7]研究显示lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织和细胞系中表达均下调，过表达lncRNA RUNX1-IT1可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力，而敲除lncRNA RUNX1-IT1则反之。LncRNA RUNX1-IT1在肝细胞癌组织中表达降低，并与临床病理特征和不良预后相关。机制研究表明RUNX1-IT1直接与miR-632结合，并作为竞争性内源性RNA促进miR-632靶基因GSK-3β的表达，调控WNT/β-catenin，进而抑制肝癌细胞的生长、转移和干细胞样特征[17]。Yan等[18]研究也发现肝癌组织中lncRNA RUNX1-IT1的表达水平显著降低。过表达lncRNA RUNX1-IT1可显著抑制肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡。然而，与上述结论截然相反的是，Wu等[19]研究证实RUNX1-IT1在胶质母细胞瘤组织中表达上调，过表达RUNX1-IT1可明显上调细胞周期蛋白D1的表达，并促进胶质母细胞瘤细胞的增殖。本研究结果表明lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织及细胞中低表达，过表达lncRNA RUNX1-IT1可抑制SW480细胞侵袭和迁移能力，与Shi等[7]的结论相一致。说明lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌的进展过程中发挥癌基因功能。
较多研究证实miR-21在多种实体肿瘤中表达异常，是一个潜在的肿瘤治疗靶点和早期标志物[20]。miR-21在宫颈癌组织和血清样本中表达上调，而组织金属蛋白酶抑制因子3(Tissue metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3)在宫颈癌组织中表达下调；
miR-21通过靶向TIMP3促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[21]。miR-21在胃癌中表达明显上调，与患者临床分期、淋巴结转移相关，可能是胃癌的预后标志物[22]。miR-21在非小细胞肺癌(NSCLC)中高表达，干扰miR-21表达可抑制细胞周期蛋白D1和E1的表达，并协同抑制癌细胞的增殖能力，且miR-21通过PTEN/Akt/GSK-3β信号通路中的关键分子来调控NSCLC增殖[23]。本研究结果表明，miR-21在结直肠癌组织及细胞中表达均明显升高，抑制miR-21表达可抑制SW480细胞的侵袭和迁移能力；
通过生物信息学分析和双荧光素酶报告实验结果证实lncRNA RUNX1-IT1和miR-21存在靶向结合位点。由此我们推测，lncRNA RUNX1-IT1可能作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)吸附靶向调控miR-21表达，进而影响结直肠癌的侵袭和迁移。并且在进一步的回复实验中验证了这一猜想，在lncRNA RUNX1-IT1过表达同时上调miR-21的表达，发现上调miR-21表达可逆转过表达lncRNA RUNX1-IT1对SW480细胞侵袭和迁移的抑制作用。
综上所述，lncRNA RUNX1-IT1在结直肠癌组织和细胞系中表达下调，lncRNA RUNX1-IT1低表达通过靶向上调miR-21表达调控SW480细胞侵袭和迁移，这意味着lncRNA RUNX1-IT1有可能成为结直肠癌的分子治疗靶点，其在体内的具体作用及分子机制还有待进一步研究。
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