阳春丽， 任宝军， 徐跃轩， 卢 赞， 钱 净， 杨文迪， 马永鑫， 赵晓丽
近年来，随着抗菌药物、免疫抑制剂、抗肿瘤药物的广泛使用，以及外科手术和其他辅助治疗操作的大范围开展，引起定植菌群紊乱以及机体屏障破坏，使得机会性致病菌有机可乘，导致侵袭性念珠菌病的发病率及病死率逐年升高[1]。白念珠菌是典型的条件致病菌，定植在健康宿主时不致病，当机体防御力下降时，打破了与病原菌间的平衡而引发疾病[2]。其中以白念珠菌血流感染最常见，致死率极高，传统的真菌培养鉴定耗时长，不利于早期诊断。分子生物学方法是目前微生物快速鉴定的重要方向，全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)能够系统地描述突变类型的全部序列，但操作繁琐且成本较高，临床可替代方法多。肽核酸-荧光原位杂交(peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization，PNA-FISH)，在荧光原位杂交基础上，将带负电荷的DNA探针替换为不带电荷的肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)探针，整个杂交过程遵循碱基互补配对原则，最终在荧光显微镜下观察结果，适用于常见病原菌检测，易漏检未知序列病原菌。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是通过气化基质与待测菌复合物，解析电离待测菌蛋白质，根据分子质荷比(m/z)确定菌种，具有检测范围广、通量高的优势。但直接鉴定血培养阳性标本，样本前处理步骤更复杂，成本较高，准确性有待进一步确证，而真菌细胞壁较厚，直接鉴定难度大[3-4]。因此，MALDI-TOF MS大多用于鉴定分离培养后的单个新鲜菌落。本实验以VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪为参照，以实验室留存的白念珠菌100株制备模拟血培养阳性标本，再利用PNA-FISH技术、MALDI-TOF MS两种方法对白念珠菌进行鉴定。
1.1研究菌株来源 选取2021年昆明市第一人民医院微生物室留存的、临床分离的白念珠菌100株(按时间顺序标注1-100号)，其中来源于痰液标本84株，粪便标本8株，尿液标本3株，血液标本2株，阴道分泌物、伤口分泌物、引流液标本各1株。金黄色葡萄球菌ATCC 25923、表皮葡萄球菌ATCC 12228、粪肠球菌ATCC 29212、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、白念珠菌ATCC 14053、热带念珠菌ATCC 750、光滑念珠菌ATCC 15126、克柔念珠菌ATCC 14243等质控菌株，来源于国家卫生部临床检验中心和云南省临床检验中心。
1.2实验试剂及耗材 白念珠菌PNA探针(探针序列由达安基因公司提供，探针合成由GenScript公司完成)、细菌检测标准品、甲酸、乙腈(美国Sigma公司)、基质液、质谱靶板(德国Bruker Dalonik公司)、需氧血培养瓶[梅里埃诊断产品(上海)有限公司]、革兰染液、1xPBS、氯化钾、甲醇、冰醋酸、70%乙醇、85%乙醇、无水乙醇、20XSSC、0.3%NP-40、异硫氰酸荧光素染液(fluorescein isothiocyanate isomer，FITC)、0.45%盐水、多聚赖氨酸防脱玻片、盖玻片。
1.3实验仪器 OLYMPUS CX33荧光显微镜、杂交仪、Bruker质谱仪、BACT/ALENT3D-240全自动血培养系统、麦氏比浊仪、VITEK 2 Compact梅里埃全自动细菌鉴定仪、台式高速离心机、旋涡混合器、二氧化碳培养箱、生物安全柜、37℃恒温孵育箱、低速离心机。
1.4方法 根据《全国临床检验操作规程》第4版[5]进行病原菌分离培养、纯化鉴定以及实验室质量控制。分离培养合格后，挑取单个菌落配制0.5麦氏单位菌悬液，使用一次性无菌注射器抽取100 μl调好的菌液，注入需氧血培养瓶，做好标记，放置于全自动血培养系统BACT/ALENT 3D-240中培养，待其报阳。PNA-FISH是直接取约5 ml阳性菌液进行预处理，滴片观察，杂交前处理，杂交及洗片，在荧光显微镜下观察结果。MALDI-TOF MS需取少量菌液接种至沙保弱平板，培养出单个新鲜菌落，再利用甲酸乙腈提取法制备样本，完成质谱测定，记录质谱结果。
2.1100株白念珠菌PNA-FISH鉴定结果
2.1.1 PNA探针特异性验证结果 共有10株标准菌株，仅白念珠菌ATCC 14053可见特异性绿色荧光，其他念珠菌及细菌均未观察到荧光，特异度为100%，阳性质控、阴性质控均在控，荧光结果见图1。
ⓐ白念珠菌ATCC 14053；
ⓑ热带念珠菌ATCC 750；
ⓒ克柔念珠菌ATCC 14243；
ⓓ光滑念珠菌ATCC 15126；
ⓔ金黄色葡萄球菌ATCC 25923；
ⓕ表皮葡萄球菌ATCC 12228；
ⓖ粪肠球菌ATCC 29212；
ⓗ大肠埃希菌ATCC 25922；
ⓘ铜绿假单胞菌ATCC 27853；
ⓙ肺炎克雷伯菌ATCC 700603
2.1.2 PNA-FISH与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定方法的符合率 100株白念珠菌模拟血培养样本，98株可观察到特异性绿色荧光，2株未见荧光。因此，PNA-FISH技术与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定方法的符合率为98%，见表1。荧光结果见图2。
表1 两种方法检出白念珠菌情况
ⓐ66号白念珠菌；
ⓑ8号白念珠菌
2.1.3 PNA-FISH鉴定时间 采用PNA-FISH技术直接鉴定100株白念珠菌模拟血培养样本，需要的平均鉴定时间为(2.5±0.5)h。见表2。
表2 PNA-FISH鉴定白念珠菌模拟血培养标本的时间
2.2100株白念珠菌MALDI-TOF MS鉴定结果
2.2.1 MALDI-TOF MS鉴定念珠菌结果 MALDI-TOF MS准确鉴定出了白念珠菌ATCC 14053、热带念珠菌ATCC 750、光滑念珠菌ATCC 15126、克柔念珠菌ATCC 14243。
2.2.2 MALDI-TOF MS分析与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定方法的符合率 采用MALDI-TOF MS鉴定100株白念珠菌，最低分值为2.008，平均分值为2.191，均准确鉴定到白念珠菌种水平(分值>1.999)，与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定方法的符合率为100%，质谱结果见图3。
ⓐ20号白念珠菌质谱分值为2.453；
ⓑ71号白念珠菌质谱分值为2.283
2.2.3 MALDI-TOF MS鉴定时间 100株白念珠菌模拟血培养样本报阳后，分离出单个新鲜菌落需18～24 h。采用MALDI-TOF MS鉴定单个菌落，需要的平均时间为3～5 min。因此，MALDI-TOF MS的平均鉴定时间为(22.0±0.6)h。
3.1白念珠菌是真菌性血流感染的主要病原体，也是医院感染控制的重要目标。Kutlu等[6]研究发现，念珠菌血症感染率为4.7%，30 d粗死亡率高达56.7%。我国一项针对67家重症监护室的研究数据显示，侵袭性念珠菌病发生率为0.32%，死亡率为36.6%[7]。此外，移植患者念珠菌血症的发病率达3.5%[8]，肝硬化患者达7.6%[9]。念珠菌血症病原菌中，以白念珠菌为主，占30%～55%[6，10-11]。究其原因是念珠菌血症起病隐匿，临床特征不典型，而真菌的传统培养与鉴定时间长，不利于临床及时诊断，容易延误病情，导致患者预后不佳。因此，白念珠菌的快速鉴定是微生物诊断亟待解决的问题。
3.2近年来，多位点序列分型、短串联重复序列、微卫星基因分型、环介导等温扩增等分子生物学技术的发展，有助于逐步实现微生物快速鉴定的目标。PNA-FISH技术是利用PNA探针，在一定条件下与待测菌遗传物质进行杂交，形成稳定的杂合双链核酸分子，针对念珠菌检测具有良好的特异性和敏感性。MALDI-TOF MS整个鉴定过程，包括气化样本、解析样本、电离样本并测量分子质荷比，绘制质谱图，在数据库匹配已有菌株峰值图得出质谱分值，标准峰越多，分值越高；
同理，错误峰或无峰越多，分值越低。
3.3瑞典Karolinska大学医院研究表明，PNA-FISH技术可准确鉴定98.7%的念珠菌[12]。课题组前期采用PNA-FISH技术鉴定血培养中白念珠菌的特异度为100.0%，与念珠菌显色平板比对符合率为97.5%[13]，平均用时(4±0.2)h。本研究中，PNA探针鉴定白念珠菌的特异度为100%，与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定方法的符合率为98%，平均耗时(2.5±0.5)h。本研究的鉴定符合率与上述研究存在一定差异，考虑与实验标本量差异以及参照方法不同有关。后期实验可进一步优化PNA探针设计合成，并增加罕见菌的特异性验证，保证PNA探针与目标念珠菌杂交效率。
3.4本研究中，Bruker质谱仪鉴定100株白念珠菌，与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定方法的符合率为100%，高于国外Teke等[14]研究(98.7%)以及中国医院侵袭性真菌监测网(China Hospital Invasive Fungi Surveillance Network，CHIF-NET)报道数据(98.8%)[15]。考虑主要原因为鉴定标本是经传代培养后的单个菌落，避免了其他物质干扰，且标本量少。但MALDI-TOF MS鉴定白念珠菌的平均时间仍较长，后期实验将进行真菌血培养阳性标本的直接鉴定，进一步缩短MALDI-TOF MS鉴定真菌性血流感染病原菌的时间[3，16]，并在实际工作中不断丰富质谱数据库，为临床提供准确的病原菌鉴定报告。
3.5就鉴定的结果而言，传统鉴定方法是镜下结果加生化反应，镜下观察可初步判断真菌感染，但不能确定种属以及混合感染，传统生化鉴定操作复杂。PNA-FISH是核酸杂交和显微镜观察，杂交操作简单，对实验人员及仪器设备要求低。质谱可批量检测病原菌的独特蛋白图谱，但质谱仪器昂贵，不利于基层医院应用推广。相较于传统血培养真菌鉴定，PNA-FISH技术可提前2 d完成微生物鉴定，MALDI-TOF MS可缩短1 d的鉴定时间。此外，针对临床常见混合感染，有学者研究报道多重PNA探针成功应用的案例[17]，而MALDI-TOF MS分析及传统鉴定均需分离出单个菌落，鉴定耗时长。PNA-FISH技术不仅具有明显的时间优势，且鉴定结果具备形态学和分子生物学的双重保证。但由于本实验是手工操作，尚存在成本较高、通量低的缺点，后期可结合流式细胞术[18]、微流控[19]等方法或采用细胞形态动力学的Accelerate Pheno自动检测系统[20]，提高样本检测通量、降低成本以及进一步缩短鉴定时间，具有较好的临床应用前景。尽管分子生物学技术应用广泛，但传统的细菌学方法，如革兰氏染色镜下结果和平板菌落生长观察仍然不容忽视。
综上所述，PNA-FISH方法鉴定白念珠菌，设备简单，鉴定结果可靠，相较于传统鉴定方法和MALDI-TOF MS方法，鉴定时间显著缩短，有较好的临床应用前景。
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