李宝福，刘柏麟，袁 兴，郝璞珩，邓齐奇，孙皖秦
(西安国际医学中心医院神经外科,陕西 西安 710100)
脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH) 是指原发性非外伤性的脑实质血管破裂出血，导致神经细胞供血不足以及周围神经组织受压，进而引发一系列代谢及功能障碍[1]。ICH作为临床工作中的一种常见的脑卒中亚型，病情凶险，病死率、致残率高，患者即使存活也会出现不同程度的神经功能损害[2-4]。近年来，有研究报道ICH后继发性脑损伤是影响存活患者生活质量的重要因素[5]。因此，ICH后及时干预继发性损伤对患者的最终预后有重要意义[6]。继发性损伤包括颅内血肿、脑水肿、炎性反应、钙超载、自由基反应等[7]。既往研究[8]表明，ICH后血肿压迫效应及周围组织的炎性反应是造成继发性损伤的关键因素之一。辅酶Q10(CoQ10)作为呼吸链中不可或缺的递电子体，亦是胞内重要的内源性抗氧化剂，近年来逐渐成为研究热点[9-11]。研究[12-15]发现，CoQ10有着清除自由基、抗脂质过氧化、增强免疫等作用。但其在神经保护及ICH后继发性脑损伤方面的研究仍然较少，所得结论还不足以说明CoQ10的治疗效果。本研究采用胶原酶注射法建立小鼠脑出血模型，研究CoQ10对ICH小鼠的神经功能、周围组织水肿及炎性反应和细胞凋亡的影响。
1.1 实验材料 实验动物选用无特定病原体级动物C57WT小鼠54只，8周龄，体重20～25 g，购自空军军医大学实验动物中心；
Ⅳ型胶原酶购自美国Sigma-Aldrich公司；
立体定位仪购自北京众实迪创生物科技发展有限公司；
CoQ10购于上海鼓臣生物公司；
酶联免疫吸附试验试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.2 模型建立及分组 采用胶原酶注射法建立小鼠脑出血模型[16]。给予腹腔注射5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)麻醉，将麻醉后的小鼠剪开头皮，暴露颅骨，于前囟前方0.2 mm，右侧旁开3 mm进行颅骨钻孔，小鼠俯卧位固定于脑立体定位仪，垂直钻孔入针，深度约3.5 mm,在小鼠基底神经节的部位注射1 μl Ⅳ型胶原酶，在实验规定时间处死模型小鼠，观察其颅内出血情况。将小鼠分为Sham组(Sham组小鼠只暴露颅骨，不进行钻孔和注射)、ICH组和CoQ10组，每组18只，其中6只用于检测脑组织水含量和mNSS评分，6 只用于酶联免疫吸附检测炎症因子水平，6只用于检测细胞凋亡水平。CoQ10组脑出血模型建立6 h后，用30 mg/(kg·d)CoQ10灌胃，ICH组和Sham组用等量0.9%氯化钠溶液灌胃，共1周。过程中出现小鼠死亡要及时补充。
1.3 神经功能缺损评分 模型建立7 d后，对三组小鼠进行mNSS评分，分别从运动、感觉、平衡、反射方面测试小鼠的神经功能，不能完成某项测试项目则记1分，即得分越高，小鼠神经功能缺损越严重。mNSS评分为0～18分，0分为正常。
1.4 脑水含量计算 造模7 d给药后，处死麻醉后小鼠，取出脑组织，立即称量湿重，在120 ℃烘箱烘干至恒重，称量干重，脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重 ×100%。
1.5 酶联免疫吸附试验检测脑组织炎症因子表达水平 取损伤区周围大脑皮层组织并匀浆，然后在4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液用于检测。根据制造商说明，使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测细胞因子白介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度。先使用标准品绘制标准曲线，再将样品测得的吸光度带入标准曲线方程计算小鼠脑组织中IL-6及TNF-α水平。
1.6 TUNEL染色法检测细胞凋亡水平 灌注取脑后，将脑样品浸泡在30%的蔗糖中，直至沉到底部。然后冰冻切片，切片厚度20 μm。4%的多聚甲醛在室温固定 15 min后，用 PBS 在室温漂洗三次×10 min。
然后切片在含 0.1% Triton-X-100 的 PBS 孵育15 min。
再次 PBS 室温漂洗三次× 10 min，用5%的BSA封闭1 h。采用商业试剂盒进行TUNEL染色，根据厂商说明，配制TUNEL溶液并避光孵育10 min，PBS清洗后用DAPI覆盖切片，再次清洗、封片。切片在共聚焦显微镜下观察并拍照，计算TUNEL阳性细胞百分比。TUNEL阳性细胞百分比=TUNEL阳性细胞数量/DAPI阳性细胞数量×100%。
2.1 三组小鼠神经功能缺损评分比较 于给药7 d后进行mNSS评分，结果显示ICH组神经功能缺损评分均明显高于Sham组(P<0.001)，表明建模成功，而经CoQ10治疗的小鼠神经功能缺损均得到明显改善(P<0.05)，见图1。
注：Sham组与ICH组比较，***P<0.001；
Sham组与CoQ10组比较，***P<0.001；
CoQ10组与ICH组比较，*P<0.05
2.2 三组小鼠脑水肿程度比较 于给药7 d后通过小鼠脑组织干重湿重的测量值计算脑组织水含量从而评估小鼠脑水肿的程度，结果表明，与Sham组相比，ICH组脑水肿程度显著增高(P<0.001)；
与ICH组相比，CoQ10组脑水肿程度明显降低(P<0.01)。见图2。
注：Sham组与ICH组比较，***P<0.001；
Sham组与 CoQ10组比较，**P<0.01；
CoQ10组与ICH组比较，**P<0.01
2.3 三组小鼠脑组织细胞凋亡水平比较 TUNEL染色结果表明，ICH组小鼠TUNEL阳性细胞的百分比明显高于Sham组(P<0.001)；
而经CoQ10治疗好，其百分比要明显下降(P<0.001)，表明CoQ10可减少脑出血小鼠的细胞凋亡。见图3。
注：Sham组与ICH组比较，***P<0.001；
Sham组与CoQ10组比较，***P<0.001;CoQ10组与ICH组比较，***P<0.001
2.4 三组小鼠脑组织炎症因子水平比较 与Sham组相比，ICH组小鼠脑组织IL-6、TNF-α的浓度明显增高(均P<0.001)；
给予CoQ10治疗后，小鼠脑组织中炎症因子浓度降低(均P<0.01)。见图4、5。
注：Sham组与ICH组比较，***P<0.001；
Sham组与CoQ10组比较，***P<0.001;CoQ10组与ICH组比较，**P<0.01
ICH是一种常见的有着较高致残率和病死率的脑卒中类型，由于脑出血后脑损伤的发生，患者即使幸存，也多将面临较低的生活质量和较重的家庭、社会负担[17]。
注：Sham组与ICH组比较，***P<0.001；
Sham组与CoQ10组比较，***P<0.001;CoQ10组与ICH组比较，**P<0.01
ICH后的脑损伤大致可分为原发性脑损伤和继发性脑损伤[18]。在原发性损伤中，出血量的多少决定着血肿对临近脑组织的机械性压迫程度，临床上多采用手术清除血肿，然而这种方式并不能缓解治疗脑出血后的继发性损伤[19]。继发性损伤机制复杂，包括血脑屏障损伤、脑水肿、细胞凋亡等，此外，炎性反应也是脑出血后继发性脑损伤的重要机制之一，脑出血后，小胶质细胞等中枢神经固有的免疫细胞激活，释放大量炎症因子包括IL-6、TNF-α等，进而引起瀑布级联反应，影响患者预后[18-19]。虽然近年来有大量的研究让人们对脑出血后脑损伤的病理生理机制的认识有了很大提高，但仍然缺乏有效的诊治手段以改善患者预后。因此，寻找有效的临床措施以避免ICH后脑损伤非常有研究价值。CoQ10作为一种脂溶性醌类化合物，是胞内重要的内源性抗氧化剂，有着清除自由基、抗脂质过氧化、增强免疫等作用[12-15]。CoQ10可用于治疗各种与细胞能量代谢不佳或氧化损伤相关的疾病，目前其已在神经、心血管、免疫和肿瘤疾病方面发挥作用。例如，多种心血管疾病如高血压、心力衰竭、心肌病、动脉粥样硬化等均与CoQ10的缺乏有关，补充CoQ10可在一定程度上对这些疾病产生治疗作用[20-22]。还有研究报道，CoQ10有希望用于神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等，但其在神经保护及ICH后继发性脑损伤方面的研究仍然较少[23-24]。
本研究采用胶原酶注射法建立脑出血小鼠模型，在小鼠基底神经节的部位注射 Ⅳ型胶原酶，该法建立的模型稳定性高、重复性好，且符合临床患者病程的进展[25]。接着我们研究了CoQ10对于脑出血小鼠的神经保护作用。我们于脑出血小鼠模型建立后7 d进行神经功能评分，结果表明ICH组小鼠神经功能评分均明显高于Sham组，而经CoQ10治疗的小鼠神经功能评分明显低于ICH组；
此外，CoQ10组脑水肿程度也明显低于ICH组，显示CoQ10对脑出血小鼠具有一定的神经保护作用。为了进一步研究CoQ10对脑出血后炎性反应的影响，我们通过酶联免疫吸附试验检测了小鼠脑组织中炎症因子IL-6、TNF-α的水平，研究表明ICH组小鼠脑组织中IL-6、TNF-α的浓度明显增高，这与过去的研究相印证，而给予CoQ10治疗后，小鼠脑组织中IL-6和TNF-α浓度显著降低，表明CoQ10治疗可抑制脑出血后炎症因子的产生，降低脑出血后的炎性反应。最后我们进行了细胞凋亡的检测，结果显示相较于Sham组，ICH组细胞凋亡明显增加，而CoQ10治疗较ICH组可以减轻细胞的凋亡。我们的研究表明，CoQ10具有对脑出血小鼠的神经保护作用，这种作用可能由CoQ10抑制小鼠脑出血后IL-6、TNF-α的释放，进而起到降低脑水肿程度，减少细胞凋亡等作用。
综上，CoQ10可减轻脑出血小鼠神经功能障碍，降低脑水肿程度，减少炎症因子产生，改善细胞凋亡，其可能在脑出血后继发性脑损伤方面发挥治疗作用，但作用机制及临床应用范围的还需要进一步探索。
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