张国华，金振华，张备，王丽坤，薛沾枚，海龙，张艳，刘雪松，南景东，沈思思，吕明哲
(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005)
近年，致病性大肠杆菌引起的羔羊腹泻给养羊业造成了很大的经济损失，具有致病性的大肠杆菌会引起畜禽以及人类腹泻等临床症状，当发病较严重时会引起脑膜炎等疾病，严重地损害了养殖户的经济利益[1]。目前，治疗该类疾病主要的办法就是使用抗生素进行治疗，但由于长期不科学用药，导致细菌耐药性的问题日益严峻[2]。细菌耐药性不仅仅是兽医临床的关注重点，医学及环境学也越来越重视这方面的问题[3]，羊源致病性细菌产生耐药的报道越来越常见。为了加强齐齐哈尔市羊源耐药性大肠杆菌的检测和分析，保证养殖场以及养殖户更合理的用药，本研究对齐齐哈尔市某羊场发生的致病性大肠杆菌进行分离鉴定，检测7种治疗羔羊腹泻常用抗生素的耐药情况，并对其耐药基因进行检测，为更好地防控致病性大肠杆菌引起羔羊腹泻提供理论依据，以减少或避免滥用药的现象，更好地防控该病。
1.1 试验材料
1.1.1试验菌株
齐齐哈尔市某羊场饲养70只绵羊，其中5只羔羊发生腹泻，采集1只腹泻严重的羔羊粪便进行细菌分离，质控菌株为大肠杆菌ATCC25922。
1.1.2试验试剂
MH、麦康凯、伊红美蓝培养基以及血平板购自青岛海博生物技术有限公司。ExTaq、Marker(trans2k)购自TaKaRa。细菌基因组提取试剂盒(50次)购自天根生化科技有限公司。药敏片购自杭州微生物试剂有限公司。DNA引物由吉林库美合成。
1.2 方法
1.2.1细菌的分离及鉴定
将腹泻羔羊的粪便涂抹在血平板、麦康凯、伊红美蓝培养基上，恒温培养箱37 ℃培养约24 h。对培养出的菌落进行革兰氏染色，确定细菌形态特征。
1.2.2生化试验
完成细菌分离和鉴定后可根据细菌形态学特征初步判定为何种细菌，然后根据不同细菌的特性选择生化管，在无菌环境下进行相应操作。
1.2.316SrDNA鉴定
将细菌在液体培养基中培养，取1 mL菌液12 000 r/min 离心10 min，保留200 μL液体按照天根细菌DNA提取说明书进行操作，获得的DNA使用16S rDNA通用引物进行扩增，根据文献进行合成[4]。16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
16S-R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，片段长度1 465 bp。将阳性PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到长度约1 465 bp的特异性条带，扩增产物送至吉林库美测序。测序结果在GenBank进行比对分析。
1.2.4小鼠致病性试验
将分离纯化的细菌在液体培养基中进行培养，细菌制备为浓度108 CFU/mL的菌液，细菌注射根据文献[5]，取小鼠8只，分为两组，试验组与对照组各4只，试验组接种0.5 mL制备好的菌液，对照组接种等量的液体培养基，观察两组小鼠是否发生异常。
1.2.5药敏试验
实验根据美国临床检验标准委员会(NCCLS)(2017)推荐的K-B纸片法进行操作[6]。将培养的菌落于MH肉汤培养基培养16 h后，使用比浊仪将菌液稀释至0.5麦氏单位，将菌液均匀地涂布于MH琼脂培养基表面，然后将药敏片贴至适当的位置，16 h后观察药敏试验结果。
1.2.6耐药基因的检测
分离纯化得到的大肠杆菌在血液琼脂培养基上进行3次传代后，将纯化的菌落使用MH肉汤培养基培养16 h后，取1 mL菌液12 000 r/min 离心10 min，保留200 μL液体按照天根细菌DNA提取说明书进行操作，取适量的DNA应用于6对耐药基因引物进行扩增，对大肠杆菌主要的6种耐药基因进行检测，耐药基因引物序列参照文献[7-9]，引物如表1所示。
表1 耐药基因序列
2.1 细菌的分离及鉴定
腹泻羔羊粪便中分离到的细菌在血平板上进行培养有溶血现象发生，菌落光滑、湿润、微微隆起。在麦康凯培养基上生长为粉红色菌落，伊红美蓝生长为黑色具有金属光泽的菌落。革兰氏染色的结果显示该类细菌为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢。形态学符合大肠杆菌的标准。
2.2 生化试验结果
根据大肠杆菌的生化性质选定了13种生化试剂进行检测，检测结果见表2，结果显示检测的指标符合大肠杆菌的生化特性。
表2 大肠杆菌生化试验结果
2.3 16S rDNA鉴定结果
按照革兰氏阴性菌的标准提取菌液DNA，进行PCR扩增，获得大小约为1 465 bp的特异性条带，脱氧核糖核苷酸序列结果在GenBank进行对比显示与大肠杆菌菌株NC_054923.1同源性高达99.15%。PCR扩增结果见图1。
M：DNA Marker DL2000；
阴性对照；
阳性对照为质控扩增结果；
1:试验菌株。
2.4 动物致病性试验结果
试验组小鼠注射大肠杆菌24 h后全部死亡，对照组小鼠未见异常。剖检试验组小鼠，肝脏肿大坏死，进行细菌分离以及16S rDNA测序结果显示，分离到的细菌与本次分离到的大肠杆菌序列一致。
2.5 药敏试验结果
药敏试验结果如表3所示，可以看出，该株致病性大肠杆菌对头孢噻肟、头孢他定耐药，对四环素、环丙沙星中介，对氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星敏感。
表3 药敏试验结果
2.6 耐药基因检测结果
耐药基因结果见图2，对分离到的致羔羊腹泻的菌种进行6种耐药基因的检测，检出EBC耐药基因，未检出其他耐药基因。表明本次分离得到的致病性羊源大肠杆菌携带β-内酰胺类耐药基因。
M：DNA Marker DL2000；
阴性对照；
1:试验菌株EBC基因扩增条带。
β-内酰胺类药物是抗生素家族中的一大类，常见且比较具有代表性的药物为青霉素、头孢类药物等[10]。这类药物作用机制均是抑制细菌的胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白(PBPs)，从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。人类及动物没有细胞壁，不受β-内酰胺类药物的影响，因而这类药物对细菌具有选择性的杀灭作用，对机体的毒性较小，副作用比较少，十分适合兽医临床使用[11]。但随着抗生素的应用越来越广泛，存在着大量的不科学用药，滥用药的现象也越来越多，导致很多细菌出现了耐药性，不利于兽医临床疾病的治疗[12]。大肠杆菌作为一种常见的致病菌，当其产生致病性时会引起受到感染的对象发生腹泻、恶心、头疼等不适症状，严重者可能会危及生命。本研究分离到的致病性大肠杆菌具有一定的致病力，会使羔羊产生非常严重的腹泻，如不能得到有效的治疗会出现死亡，经过药敏试验等筛选出敏感性较高的药物氨苄西林对患病羔羊进行治疗，腹泻状况得到改善，并在5 d后痊愈。科学用药不仅可以减少不必要的经济损失，提高治疗效率，还可以尽量避免或减少耐药性的出现。
本次分离的致病性大肠杆菌携带EBC耐药基因，说明该种大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素具有一定的耐药性。细菌产AmpC酶是近年来继ESBLs之后出现的一种革兰氏阴性菌抗β-内酰胺类抗生素的耐药机制[13]。EBC型是该酶基因的一种分型，这类酶可以分解头孢类抗生素和单酰胺类抗生素，并且不会被目前临床上的β-内酰胺酶类抑制剂所抑制，因此，如在兽医临床上发现该类耐药细菌出现，治疗起来十分复杂[14]。不同地区、不同物种来源的致病性大肠杆菌携带的β-内酰胺类耐药基因检出情况有所差异，但总体来说耐药情况十分明显，对养殖业的危害很大[15-19]。
细菌对抗生素类药物的耐药性问题引起了越来越多的关注，这个问题也给抗生素在畜牧业临床中的使用带来了很大的困难。细菌的耐药性是由多重因素之间相互作用而引起的，随着人们研发越来越多种类的抗生素，耐药问题可能暂时缓解，但随之而来的是由于使用药物种类的增多，耐药菌的种类也越来越多，因此，研究细菌产生耐药性的机制至关重要，是未来解决耐药问题的一个重要方向[20]。由于耐药问题，我们要采用科学的方法进行治疗，首先要了解细菌的耐药性，精准科学用药；
其次对于耐药的细菌以及耐药基因，要研发新型药物以便应用于临床；
再次使用药物的剂量要合适，不可以过度用药也不能不按照疗程进行治疗；
最关键的是用药的时候讲究用药方法，避免出现耐药现象。在日常饲养过程中要加强饲养管理，做到以下几点可更好地降低疾病的发生，从而避免出现耐药现象：第一，关注畜禽的养殖环境卫生，注意要定期清理圈舍，定期消毒圈舍环境以及使用的器具；
第二，增加畜禽的营养水平，采用全价饲料，在日粮中添加维生素、益生菌等有益于提高畜禽免疫力的物质；
第三，对兽医临床中传染性疾病做好免疫接种，制订合理的免疫计划；
第四，当发生疫病的时候，要采取科学的方法进行治疗，不可滥用药物。相信通过采取合理的用药方案以及科学的饲养管理，可以避免或降低细菌耐药性的出现[21]。
本次试验从羔羊腹泻样本中分离出一株致病性大肠杆菌，并通过药敏试验及耐药基因检测发现该株大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药，携带EBC耐药基因。该细菌对头孢噻肟、头孢他定耐药，对四环素、环丙沙星中介，对阿米卡星、庆大霉素、氨苄西林敏感。本次试验结果为该羊场治疗羔羊腹泻提供了科学的用药依据。
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