张 健，李 赫，于 翔*，龚 元
(1.辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁 辽阳 111000；
2.荆州市民康生物科技有限公司，湖北 荆州 434300)
日本医蛭(HirudonipponicaWhitman)俗名日本医水蛭、水蛭、稻田医蛭，隶属环节动物门(Annelida)蛭纲(Hiru-dinea)无吻蛭目(Arhynchobdellida Blanchard)医蛭科(Hirudinidae Whitman)医蛭属(HirudoLinnaeus)。日本医蛭在我国分布很广，北起东北各省和内蒙古，西至四川和甘肃，南达台湾和广东；
在日本、俄罗斯的远东地区以及蒙古也有分布[1]。日本医蛭是《中华人民共和国药典》收录的水蛭药材基原中唯一吸食动物血液的品种，是治疗心血管疾病的主要原料[2]。医蛭抗凝活性成分水蛭素是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂，具有防治动脉粥状硬化、高血压、高血脂和脑中风等疾病[3-8]的功效。
近年来，由于环境污染和滥捕等人为活动因素的影响，导致医蛭野生资源破坏严重，野生种群数量锐减[9-10]。为保护这一重要资源，医蛭的人工繁养殖势在必行。目前，提高日本医蛭人工繁养殖产量的方法主要是调节养殖温度和密度。本研究在已有繁养殖技术的基础上[11-16]，依据医蛭越冬后翌年交配产茧的繁殖习性[1]，通过人工控温的方法缩短越冬时间，从而增加日本医蛭越冬次数，最终达到增加交配次数和提高产量的目的，这在国内尚未有相关报道。
日本医蛭来源于辽宁省辽中县，经人工饲养后，挑选无伤病、活力旺盛、无生殖环带的日本医蛭进行试验。
养殖用土采自辽阳市郊稻田，经新洁尔灭消毒、冲洗、曝晒后，放入网箱(350 mm×145 mm×115 mm)，网箱土层厚度为40 mm，最后将网箱放入食品级塑料箱(380 mm×175 mm×145 mm)内，用曝气3 d的自来水浸透土层后备用。
2.1 日本医蛭人工越冬管理
人工越冬繁殖试验共分2次进行，越冬期为30 d(第1次是2020年5月20日至2020年6月19日，第2次是2020年11月5日至2020年12月5日)。在未经历过越冬的日本医蛭中随机挑选60条平均分至2箱(1号箱和2号箱)，进行第1次越冬试验；
在完成第1次越冬和产茧的亲蛭中再随机挑选30条进行第2次越冬繁殖(3号箱)。两次试验开始前，先用微湿纱布除去亲蛭体表附着的赃物和水分，称量个体体质量(精确到0.01 g)。待日本医蛭暂养1周状态稳定后，放入恒温恒湿箱开始逐渐降温，待温度降至6 ℃时，开始正式越冬。在越冬过程中，根据土壤干湿情况平均每3 d喷洒曝气水1次，并挑拣钻出土层状态不好的日本医蛭。
2.2 日本医蛭交配繁殖
30 d后，恒温恒湿箱缓慢提温至16 ℃，待医蛭完全复苏后，从越冬箱捡出称取体质量、喂食猪血，最后放入到加注曝气3 d自来水(水面高30 mm)，水温保持(20±1) ℃的塑料箱内，进行交配繁殖。
交配期间，为防止外界干扰带来的应激反应，在塑料箱上盖1层透气遮阴网，每5 d观察1次，记录生殖环带产生情况，最后将产环亲蛭放入土层厚度4 cm的塑料网箱中。卵茧产出后，测量卵茧质量(精确到0.01 g)和长短径(称重前用吸水纸除去卵茧表面附着的水分)，卵茧的长径和短径用游标卡尺测量。试验结束后，测量亲蛭的个体体质量，统计存活条数、卵茧数量及卵茧大小、体质量，计算亲蛭体质量下降率、存活率和产茧量。
2.3 日本医蛭卵茧孵化
卵茧孵化在26 ℃的恒温培养箱中进行。在带有透气孔的塑料盒内放置培养皿，将卵茧放于培养皿上，卵茧间距约10 mm，于卵茧上平铺1层润湿的医用纱布。盒内注水约10 mm，将医用纱布两端浸入水中，使卵茧和纱布保持一定的潮湿度。孵化期间每日检查卵茧的孵化情况，及时将孵出仔蛭挑出、称取体质量，并捡出已孵仔蛭的空壳和死茧。试验结束后，统计卵茧孵化率，测量仔蛭体质量(精确到0.000 1 g)。
2.4 亲蛭2次人工越冬繁殖试验
在完成第1次产茧的亲蛭中，随机挑选30条，饲料强化后，按照第1次越冬的方式方法进行第2次人工越冬，时间为30 d。越冬结束后进行交配繁殖，统计医蛭的交配率、繁殖前后体质量下降率、卵茧孵化率等繁殖生物学指标。
2.5 数据统计与分析
描述性统计值用“平均值±标准差”表示，其中：
×100%，
3.1 日本医蛭越冬成活率和体质量变化
越冬共计30 d。越冬结束后，统计日本医蛭存活数量：1号箱、2号箱和3号箱分别存活30、30和28条；
成活率分别为100%、100%和93%，3组平均存活率约为98%(见表1)。
表1 日本医蛭越冬前后体质量变化
由表1可知，1号箱和2号箱越冬前平均体质量为(0.99±0.33) g，越冬后平均体质量为(0.85±0.30) g，平均体质量下降率为(14.07±1.05)%；
3号箱越冬前平均体质量为(1.33±0.64) g，越冬后平均体质量为(1.12±0.43) g，平均体质量下降率为15.79%。由此可知，日本医蛭经过30 d越冬后，2个试验组医蛭平均体质量下降率相当，且降低均比较明显。
3.2 日本医蛭交配率、产茧前后形态特征和体质量变化
在(20±1)℃条件下，日本医蛭初次越冬1号箱和2号箱产环数量分别为17和18条，交配率分别为56.70%和60.00%，平均交配率为58.35%，高于第2次越冬3号箱的13条和46.40%的平均交配率(见表2)。产茧前，日本医蛭生殖环带较体色明显，呈浅土黄色(见图1)，产茧后生殖环带消失，其形态与其他医蛭无差别。
由表3可知，产茧前1、2号箱平均体质量为(1.09±0.44) g，3号箱为(1.23±0.60) g；
产茧后1、2号箱平均体质量为(0.71±0.29) g，体质量下降率为(34.65±1.41)%；
3号箱平均体质量为(0.77±0.44) g，体质量下降率为37.40%。产茧前后，个体体质量下降明显。
表2 日本医蛭产环数量及交配率
表3 日本医蛭产茧前后体质量变化
3.3 卵茧数量、大小及收集时间
受精卵主要产在土壤中下层的孔隙中，卵茧呈椭圆形，外面包裹1层较厚的淡黄色泡沫状保护层(见图2)。产茧期间共翻土5次(3号箱4次)取卵茧。如表4所示：1、2号箱获取卵茧66枚，平均产茧量(1.10±0.04)枚/条，卵茧质量和长短径平均值为(0.12±0.04)g和(1.11±0.18) cm×(0.81±0.16) cm；
3号箱获取卵茧24枚，平均产茧量为0.86枚/条,卵茧质量和长短径平均值为(0.12±0.03)g和(1.12±0.19) cm×(0.79±0.14) cm。1、2号箱集中产茧期在2020年7月25日—2020年8月13日，共计19 d，收集茧53枚，占1、2号箱卵茧总数的80.30%；
3号箱集中在2020年1月16日—2020年2月6日，共计21 d，收集茧21枚，占3号箱卵茧总数的87.5%。
表4 日本医蛭产茧量及卵茧形态
表5 日本医蛭不同时间产卵茧数量
3.4 日本医蛭卵茧孵化率及初孵仔蛭
卵茧孵化在(26±1) ℃的恒温培养箱中进行。2次孵化分别进行了54和51 d。1、2号箱活茧合计55枚，平均孵化率为83.27%(见表6)；
共孵化仔蛭573条，平均产仔蛭数为10.42条/枚，平均体质量为(0.005 1±0.004 7) g，最大体质量为0.018 3 g，最小体质量为0.000 9 g。3号箱活茧22枚，平均孵化率为91.67%(见表6)；
孵化仔蛭178条，平均产仔蛭数为8.09条/枚，平均体质量(0.005 4±0.002 6) g，最大体质量为0.011 6 g，最小体质量为0.001 7 g。
初孵仔蛭从卵茧一端的小孔逸出。仔蛭的体形与成蛭很像，但体表颜色略有不同，个体较大的呈深褐色，背部条纹明显；
个体小的呈浅黄色，体表透光，条纹不明显。
表6 日本医蛭孵化率
4.1 人工越冬对繁养殖的影响
在自然界中，日本医蛭11月中下旬开始潜入深土中越冬，当温度降到5 ℃左右时进入冬眠状态，停止摄食和活动，翌年4月中旬开始出土摄食和交配[1,15]。本研究依据日本医蛭繁殖生物学特性，通过人工干预越冬的方法，使日本医蛭从自然越冬4 ～ 5个月缩短到1个月，不仅降低了人工养殖过程中由于越冬期长导致医蛭体力不支、土质败坏而引起的死亡，还有效提高了繁殖效率，使日本医蛭1年交配1次提高到1年交配2次(2020年7月和2021年1月)。本研究中，第2次越冬繁殖试验交配率为46.40%，略低于第1次越冬繁殖试验的平均交配率58.35%，这可能有两方面的原因：一方面是由于越冬时间短，个别医蛭性腺尚未完全恢复；
另一方面是在交配过程中亲蛭受到外界干扰而导致交配失败。这在今后的试验中还有待进一步的研究。
4.2 日本医蛭产茧前后体质量变化及产茧量
2次越冬试验产茧前平均体质量分别为(1.09±0.44) g和(1.23±0.60) g；
产茧后平均体质量分别为(0.71±0.29) g和(0.77±0.44) g，体质量下降率分别为(34.65±1.41)%和37.40%，2次越冬试验之间体质量和体质量下降率差异变化不显著，这与张健等日本医蛭产茧后30% ～35%的体质量下降率的研究结果相近[11]。由此可见，2次越冬产茧并不会过多消耗医蛭体能而降低其活力。在产茧量方面，2次越冬日本医蛭平均产茧量分别为(1.10±0.04)枚/条和0.86枚/条，第2次交配率低于第1次交配率是导致平均产茧量略低的主要原因。而在相关的医蛭科水蛭繁殖研究中，本试验2次平均产茧量均低于已有报道的菲牛蛭、宽体金线蛭和日本医蛭的平均产茧量3.83枚/条、1.80和0.70枚/条[11-12,16]，这可能与水蛭种类、个体大小、生活习性、生态环境以及试验条件等因素有一定关系。
另外，本研究中还发现，当受到人为刺激或惊扰时，正在产茧的日本医蛭会出现逃逸现象而终止产茧；
已产卵茧会出现未成形及无法形成土黄色蜂窝状或海绵状保护膜的情况，这种卵茧不能孵化出仔蛭。因此，在繁殖过程中，应保持室内安静，维持室内温度和湿度稳定，尽量降低人为刺激和环境刺激对其交配和产茧的影响。
4.3 日本医蛭卵茧形态、大小、体质量及孵化情况
本研究中日本医蛭的卵茧呈卵圆形，茧膜分2层，卵茧外层是1层泡沫状保护层，里层是卵茧膜，膜内包裹着果冻状液体，这与资料中记载的日本医蛭卵茧形态一致[1]。两次试验卵茧每枚的平均质量、大小分别为(0.12±0.04) g、(1.11±0.18)×(0.81±0.16) cm和(0.12±0.03) g、(1.12±0.19) cm×(0.79±0.14) cm。可见，2次越冬卵茧质量和大小均无显著差异。另外，2次越冬繁殖平均孵化量分别为10.42和8.09条/枚，平均体质量分别为(0.005 1±0.004 7) g和(0.005 4±0.0026) g，与已有报道日本医蛭卵茧平均孵化量(8.5±0.97)条/枚、平均体质量(0.007 7±0.002 5) g结果相符[11]。由此说明短期越冬和2次繁殖对卵茧孵化质量无明显影响。
目前，关于日本医蛭人工繁殖的相关研究较少，人工增繁殖技术还不太成熟。而本研究通过人为改变越冬条件，缩短越冬时间，使得交配、产茧和孵化从1年1繁提高到1年2繁，初步实现了仔蛭的增收增产，为今后日本医蛭工厂化繁养殖提供了一定的参考。
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