李丽莉，张泽虹，马 强，刘 治，李晓晶，邰 玉，杨忠彬，段 超，任富玉，苏 燕
(包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040)
三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)俗称砒霜，是最古老的毒物之一，无臭无味，外观为白色霜状粉末[1]。我国最早将传统的“毒药”转化成了一种抗癌“利器”。目前，临床主要将As2O3作为化疗药物用于急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)等恶性血液系统肿瘤的治疗[2-5]。红细胞与白血病细胞共同存在于血液循环系统中，也是化疗药物作用的重要靶细胞。虽然已有研究发现三价砷对红细胞有损伤作用[6-12]。但对As2O3对红细胞的毒性作用和机制尚缺乏深入研究。本研究拟采用CCK-8实验和溶血率实验观察As2O3对红细胞的毒性，并探讨其机制，为阐明As2O3抗肿瘤机制、指导临床合理用药提供理论依据。
1.1血液来源 红细胞来自23～33岁健康自愿献血者，本研究得到包头医学院伦理委员会审批，依据实验要求，在献血前与每位志愿者签署知情同意书。
1.2实验仪器和试剂 多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific，3001)、CCK-8(ApexBio Technology LLC，K1018)、RPMI Medium 1640培养基(Gibco Life Technologies，C11875500BT)、Foetal bovine serum defined(Thermo Fisher Scientific，SH30070.03)、Arsenic(Ⅲ) oxide(ALDRICH，202673)，其他化学试剂均为国产分析纯，所有实验用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm)。As2O3溶液的配制：称取0.098 9 g As2O3加入1 mol/L NaOH溶液2 mL，混匀后，加入盐酸调pH至7.4，加入生理盐水定容至10 mL，0.22 μm滤器过滤。
1.3红细胞样本制备 每次分别采集4名献血者的清晨空腹肝素抗凝全血5 mL，2 000 r/min离心10 min，去除白膜层和血浆；
用生理盐水重悬后，2 000 r/min离心10 min，弃上清，重复洗涤3次，将得到的压积红细胞混合，再用等体积的生理盐水重悬后，2 000 r/min离心10 min，弃上清后得到混合压积红细胞备用。
1.4CCK-8检测 利用培养液(RPMI Medium 1640+10 %胎牛血清)重悬制备好的混合压积红细胞，细胞计数后，取180 μL红细胞悬液加入96孔细胞培养板，使每孔包含3.2×107个红细胞，然后分别加入20 μL不同浓度的As2O3溶液，使As2O3终浓度分别为0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L、3.2 mmol/L。此外，设置对照组即0 mmol/L组(180 μL细胞悬液加20 μL生理盐水)。37 ℃，5 % CO2孵育48 h，向每孔加入CCK-8试剂20 μL，在450 nm测定各孔吸光度值。利用以下公式计算细胞存活率，利用SPSS 26计算IC50。
细胞存活率(%)=(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100 %。
1.5溶血率检测 用生理盐水重悬压积红细胞，计数后，用生理盐水调节细胞数为1.6×105个/μL。取200 μL红细胞悬液，向其中分别加入800 μL不同浓度的As2O3溶液，使As2O3的终浓度分别达到0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L、3.2 mmol/L，阳性和阴性对照样本中分别加入800 μL去离子水和生理盐水，37 ℃摇床60 r/min孵育48 h。孵育后的红细胞10 050 r/min离心5 min，分别吸取200 μL上清到96孔酶标板中，使用多功能酶标仪检测540 nm的吸光度值，并利用下列公式计算红细胞溶血率。
红细胞溶血率(%)=(实验孔吸光度值-阴性对照孔吸光度值)/(阳性对照孔吸光度值-阴性对照孔吸光度值)×100 %。
1.6能量代谢检测 取制备好的压积红细胞，分为对照组和As2O3组(每组6个平行样本，每个样本中包含500 μL红细胞)，加入同体积的葡萄糖盐溶液重悬，然后加入生理盐水及As2O3溶液，使葡萄糖和As2O3的终浓度为0.5 mmol/L和2.5 mmol/L，37 ℃，100 r/min孵育5 h。取孵育好的压积红细胞60 μL，用4 ℃ PBS，2 000 r/min离心5 min，将红细胞洗3次后转移至无酶无菌的EP管中，标记后用干冰运送至上海拜谱生物科技有限公司进行能量代谢(energy metabolism)检测及分析，检测红细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、丙酮酸(pyruvic acid，PA)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)含量。
2.1As2O3对红细胞存活率的影响 0.2 mmol/L As2O3可提高红细胞存活率(P<0.05)，0.4 mmol/L和0.8 mmol/L As2O3对红细胞存活率没有明显影响(P>0.05)，但高浓度(1.6 mmol/L和3.2 mmol/L)As2O3可明显降低红细胞的存活率(P<0.05)，见图1A。经计算As2O3致红细胞IC50为5 202 μmol/L。
2.2As2O3对红细胞溶血率的影响 红细胞溶血率随着As2O3浓度增高逐渐升高，但低浓度As2O3(0.2 mmol/L和0.4 mmol/L)对溶血率几乎没有影响(P>0.05)，0.8 mmol/L、1.6 mmol/L和3.2 mmol/L As2O3使溶血率明显增高(P<0.05)，但溶血率<6 %，红细胞破坏不严重。见图1B。
图1 As2O3对红细胞存活状态的影响图注：A：As2O3对红细胞存活率的影响；
B：As2O3对红细胞溶血率的影响；
与对照组相比，*为P<0.001，**为P<0.0001
2.3As2O3对红细胞能量代谢的影响 2.5 mmol/L As2O337 ℃孵育红细胞5 h后，红细胞内ATP、PA、NADPH含量与对照组相比均明显增高(P<0.05)，见图2。
图2 As2O3对红细胞能量代谢影响注：A：As2O3对红细胞内ATP含量的影响；
B：As2O3对红细胞内PA含量的影响；
C：As2O3对红细胞内NADPH含量的影响；
横坐标中C为对照组，A为2.5 mmol/L As2O3组；
与对照组相比，*为P<0.05，****为P<0.0001
随着医学的迅猛发展，白血病的治疗手段不断丰富，使患者的生存率不断提高，而化学治疗仍是急性白血病的最主要治疗方法。As2O3是化疗药的一种，因其对APL较好的疗效，已经成为治疗APL的一线药物[13]。而红细胞与白血病细胞共同存在于血液系统中，在研究As2O3抗白血病细胞增殖的同时，也应研究其对红细胞的毒性作用，为此本研究观察了As2O3对红细胞存活率的影响，并初步探讨其机制。CCK-8法检测结果表明，0.2 mmol/L组红细胞存活率明显高于对照组，然而，由于红细胞是终末分化细胞，无法进行增殖，因此，说明此浓度As2O3可能对红细胞有保护作用，与对照组相比红细胞破坏减少。0.4 mmol/L和0.8 mmol/L组的细胞存活率有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，当浓度继续增高时，存活率出现下降，表现出明显的毒性作用。为进一步验证此结果，我们进行了溶血率实验。溶血率检测是检测红细胞损伤和破坏的方法。由于红细胞内富含血红蛋白，红细胞损伤和破坏会导致血红蛋白释放，而血红蛋白呈红色，对540 nm可见光具有吸收性，因此可通过直接检测上清的血红蛋白吸光度值来反映红细胞的破坏情况。0.2 mmol/L组的溶血率为负值，低于对照组，虽然无统计学意义(P>0.05)，但可进一步说明0.2 mmol/L组的As2O3可能对红细胞有保护作用；
0.8 mmol/L、1.6 mmol/L、3.2 mmol/L组红细胞的溶血率开始逐步增高，但总体观察溶血不是非常严重，与CCK-8细胞存活率检测结果基本一致。
此外，通过CCK-8实验计算得到As2O3对红细胞的IC50值(5 202 μmol/L)，与我们在其他研究中得到的As2O3对白血病细胞(HL-60细胞)的IC50值(2.47 μmol/L，该数据未发表)相比，As2O3对HL-60细胞的毒性约是红细胞的2 106倍，这提示As2O3作为抗白血病治疗药物时，其对红细胞的毒性作用相对较小，而且低浓度时可能还具有保护作用。
为进一步阐明As2O3发挥红细胞保护作用的机制，我们观察了As2O3对红细胞能量代谢中间产物的影响，结果表明，2.5 mmol/L As2O3作用5 h，可使红细胞内ATP、PA及NADPH水平升高，说明该浓度条件下As2O3可能促进了红细胞的糖酵解与磷酸戊糖途径，增加了红细胞内能量来源和抗氧化能力，有利于红细胞存活，从而起到了保护作用。但Maheshwari等[6]用2.5 mmol/L的亚砷酸钠与10 %的红细胞悬液作用5 h，结果表明，红细胞内己糖激酶和丙酮酸激酶的活性分别被抑制了近3倍和4倍，葡萄糖6-磷酸脱氢酶的活性为对照的1/3。亚砷酸钠可由As2O3与NaOH反应生成，但该结果与本研究结果并不一致，可能与反应体系内红细胞的压积不同有关。在相同药物浓度条件下，Maheshwari等的实验中药物只作用于压积为10 %的红细胞，而本研究中相同药物浓度作用于压积为50 %的红细胞，这使本研究的药物浓度相对低于Maheshwari等的药物浓度。根据我们的研究结果，Maheshwari等观察到的可能是高浓度砷对红细胞的损伤作用，而本研究观察的是低浓度砷的保护作用。
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