杨玉花，雷 阳，白志元，陈 妍，张海平，张瑞军
(1. 山西农业大学农业基因资源研究中心/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，太原 030031；
2. 山西农业大学园艺学院，太原 030031)
【研究意义】大豆是全球最主要的农作物之一，同时也是人类食用植物油、大豆制品和动物饲料的主要来源之一。我国每年大豆需求量约1.1亿t，但是国内自产大豆每年仅约1500万t，缺口高达85%，对进口依赖程度极高，2020年我国大豆进口高达10 032.7万t，创下历史新高。面对当前全球愈发严重的新冠疫情，以及未来中美关系的不确定性，大豆产业已成为我国粮食安全战略中最大的软肋，随时面临“卡脖子”的风险。目前随着全球对大豆消费的日益增长，大豆产量的提高将成为我们育种研究的重要目标。然而植物生长和发育严重受到外界环境气候的影响，尤其干旱是影响全球植物地理分布并且在一定程度上限制农作物产量的主要环境因素之一。山西省地处黄土高原地区，是典型的大陆性季风气候区[1]，常年受旱灾影响，因此节水旱作是该省农业发展的战略问题。面对我国对大豆的大量需求，我国政府通过高标准农田建设、现代种业提升工程等专项，加大对大豆主产区(东北和黄淮海地区)的支持力度。山西省作为大豆黄淮海主产区之一，应加大力度全力选育高产抗旱大豆品种。然而据统计，干旱将会使大豆产量减少40%左右[2-3]，因此开展大豆抗旱相关研究迫在眉睫。【前人研究进展】目前常规大豆抗旱研究相对较多[4-6]，也有很多相关品种的审定，如陇中黄602[7]、晋豆50号[8]、合丰48、绥农28、龙小粒2号、黑农65等[9]，但是杂交大豆抗旱研究目前较少。前人对大豆抗旱性研究主要在大豆种子萌发期[6]、苗期[10-11]、花期[12]以及整个生育期[13]，通过检测萌发期、苗期、花期和成熟期生理生化指标和农艺性状，从而利用抗旱指数法和隶属函数值等方法对大豆抗旱性评价分析。【本研究切入点】本文利用课题培育的3个杂交大豆品种进行抗旱相关研究，通过PEG-6000不同浓度模拟干旱胁迫。【拟解决的关键问题】研究以期通过测定苗期叶绿素含量、光合生理指标、渗透调节物质含量以及抗氧化酶活性等，明确3个杂交大豆在抗旱生理方面的共性和特性，进而通过耐旱性比较选育抗旱杂交大豆品种。
1.1 实验材料
供试材料为3个杂交大豆品种/系，分别为晋豆48，优势豆-A-5和杂交豆6号，以上材料均由山西农业大学农业基因资源研究中心杂交大豆课题选育并提供。
1.2 种子处理
从3份杂交大豆品种/系中选择子粒完整、大小一致、表面光滑的种子各90粒，然后利用0.1%的氯化汞在超净台进行浸泡灭菌6 min。浸泡后的大豆置于灭菌水中冲洗3～4次，然后将种子置于灭菌滤纸上自然晾干表面水分。将每个材料的90粒种子分为3份，每份30粒种子置于直径为9 cm且以双层滤纸为芽床的培养皿中，加入20 mL灭菌水，与25 ℃恒温暗处理催芽。露白后挑选生长一致的幼苗置于带网格的塑料发芽盘，加入适量的Hongland’s营养液，置于PERCIVAL(ARC-41L2-AR)生长箱中生长，设置昼夜温度为30和25 ℃，相对湿度恒定60%，光暗周期为 16/8 h。待大豆生长到子叶叶片展开后，移栽到带有网格的泡沫培养板上并用定植棉固定根部(图1)，然后置于Hongland’s营养液中生长，每2 d更换1次培养液，生长至第1个三小叶期进行干旱胁迫。
图1 3个杂交大豆水培定植
1.3 干旱胁迫处理
干旱胁迫处理采用不同浓度的聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液模拟。PEG-6000溶液(Hongland’s营养液为溶液)浓度(质量比)分别设3个处理，5%、10%和20%，以Hongland’s营养液为对照(PEG-6000浓度为0%)，干旱胁迫时间为2 d。
1.4 测定项目和方法
1.4.1 光合参数的测定 用 LI-6400便携式光合仪于上午 10:00—12:00 测定叶片净光合作用速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。每个材料测定 3 株，每株测定3个叶片，最后取平均值。
1.4.2 叶绿素含量的测定 利用叶绿素仪(SPAD-502 Plus，Konica Minolta，Japan)测定不同品种大豆叶片的叶绿素相对含量。每个材料测定3 株，每株测3个不同部位，然后取平均值。
1.4.3 生理指标和抗氧化酶系活性的测定 由北京索莱宝科技有限公司购买的可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性、过氧化物酶(POD) 活性的测定试剂盒进行测定，每个指标测3次重复。
1.5 数据统计和分析
利用Excel 2010分析所有数据并作图，SAS v8进行方差分析。大豆抗旱性综合评价指标参考刘学义[14]的平均隶属函数法。
2.1 干旱胁迫对杂交大豆苗期生长的影响
使用不同浓度PEG-6000溶液对3份杂交大豆苗期胁迫结果见图2，随着浓度增大，大豆苗期生长受到不同程度的抑制。在5% PEG-6000和10% PEG-6000处理下，各材料苗期表型与对照(0% PEG-6000)无显著差异，但是在20% PEG-6000处理后与对照相比，表现出不同程度的生长抑制。
A. CK (PEG-6000 浓度0%)；
B. PEG-6000 浓度5%；
C. PEG-6000 浓度10%；
D. PEG-6000 浓度20%；
标尺：3 cm
2.2 干旱胁迫对杂交大豆苗期叶绿素含量的影响
由图3可以看出，3份杂交大豆苗期叶片在不同浓度PEG-6000溶液处理条件下叶绿素含量(SPAD值)并不一致。对照处理后，3份杂交大豆苗期叶片的叶绿素含量差异显著，优势豆-A-5苗期叶片叶绿素含量最高，为35.6，杂交豆6号为次之(35.4)，晋豆48叶绿素含量只有26.1。随着干旱胁迫的加剧，大豆苗期叶片的叶绿素含量逐渐增加，并且趋势较一致。3份杂交大豆苗期叶片叶绿素含量均随着PEG-6000溶液浓度的增加而增加，其次可以看出5% PEG-6000和10% PEG-6000处理后，优势豆-A-5苗期叶片的叶绿素含量与对照差异不显著，但是晋豆48和杂交豆6号差异显著。20% PEG-6000溶液浓度处理后，3个杂交大豆品种间呈现出显著差异，趋势与对照处理一致，优势豆-A-5苗期叶片叶绿素含量最高，为47.9，杂交豆6号为43.6，晋豆48为36.5。
不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一处理不同品种间差异显著(P<0.05)
2.3 干旱胁迫对杂交大豆苗期叶片光合生理指标的影响
由图4可以看出，随着PEG-6000溶液浓度逐渐加大，3种杂交大豆苗期叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间二氧化碳浓度(Ci)和气孔导度(Gs)变化趋势在不同品种间有差异。晋豆48苗期叶片的Pn在5%PEG-6000溶液浓度处理后表现出与对照无显著差异(图4-A)，而在10%PEG-6000和20%PEG-6000溶液浓度处理后与对照则呈显著差异，尤其20%PEG-6000溶液浓度处理后Pn由对照17.47 μmol/(m2·s)降为6.09 μmol/(m2·s)。优势豆-A-5苗期叶片Pn的下降趋势与晋豆48一致，但是随着PEG-6000溶液浓度逐渐加大，杂交大豆6号Pn逐渐下降。然而不同杂交大豆品种在同样的PEG-6000溶液浓度处理下，也表现出显著差异，如对照优势豆-A-5的Pn最大，其次是杂交大豆6号，晋豆48的Pn最低。3种杂交大豆苗期叶片的胞间二氧化碳浓度(Ci)在不同PEG-6000溶液浓度处理下变化趋势不一致(图4-B)，晋豆48苗期叶片的Ci随着PEG-6000溶液浓度的增加而降低，优势豆-A-5的Ci反而由上升趋势，杂交豆6号呈现先上升后下降的趋势，并且对照处理后3个杂交大豆苗期叶片的Ci差异不显著，进而说明干旱胁迫后对不同杂交大豆品种的Ci有不同的影响，不同浓度的PEG-6000对造成不同杂交大豆品种的Ci原因也不同。干旱胁迫对不同杂交大豆品种的气孔导度(Gs)影响趋势与Pn相近，均随着 PEG-6000溶液浓度的增大而下降(图4-C，4-D)，同一PEG-6000溶液浓度下，不同杂交大豆品种间也呈现显著差异，整体趋势优势豆-A-5受干旱胁迫后影响较小。
不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一处理不同品种间差异显著(P<0.05)，下同
分析净光合作用速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)对干旱胁迫响应的相关性(表1)，结果表明，Pn对干旱胁迫的响应分别与Gs、Ci和Tr对干旱胁迫的响应之间均存在极显著正相关(P<0.01)，而且Gs对干旱胁迫的响应分别与Ci和Tr对干旱胁迫的响应之间均存在极显著正相关(P<0.01)，Ci和Tr对干旱胁迫的响应之间也存在极显著正相关(P<0.01)。
表1 净光合作用速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)对干旱胁迫响应的相关性分析
2.4 干旱胁迫对杂交大豆苗期叶片中可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸的影响
如图5所示，随着PEG-6000溶液浓度不断增加，3种杂交大豆苗期叶片的可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量和脯氨酸含量均呈现上升趋势。可溶性糖含量在3个杂交大豆苗期叶片对照组中表现出显著差异(图5-A)，其中优势豆-A-5的可溶性糖含量最高，为32.38 mg/mL，晋豆48(29.95 mg/mL)和杂交豆6号(28.99 mg/mL)的可溶性糖含量差异不显著；
随着干旱胁迫的加剧，3个杂交大豆苗期叶片的可溶性糖含量均上升，并且不同品种间在相同浓度处理下也呈现显著差异。如图5-B所示，在4组处理中优势豆-A-5苗期叶片的可溶性蛋白含量显著高于其它两个杂交种，每个品种的可溶性蛋白含量随着PEG-6000溶液浓度的增加呈缓慢增长趋势，没有可溶性糖含量和脯氨酸含量(图5-C)增加幅度大。干旱胁迫后，脯氨酸的含量随着PEG-6000溶液浓度的增加而急剧增加，在PEG-6000溶液浓度为20%处理后，晋豆48 的脯氨酸含量最高，为992.99 μg/g，其次是优势豆-A-5，为868.27 μg/g，杂交豆6号最低，为836.67 μg/g。从以上结果可以看出优势豆-A-5较其它两个杂交豆耐旱。
图5 不同浓度PEG-6000处理对杂交大豆苗期叶片渗透调节物质的影响
2.5 干旱胁迫对杂交大豆苗期叶片中抗氧化酶活性的影响
干旱胁迫后，3种杂交大豆苗期叶片中抗氧化酶活性随着PEG-6000溶液浓度的增加，其含量也呈现急剧上升趋势(图6)，说明干旱胁迫促使杂交大豆体内形成免受伤害防御系统，从而超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)作为主要保护酶其活性显著增强。5%PEG-6000和10% PEG-6000处理下，3个杂交种苗期叶片中的SOD活性与对照相比均有上升，但是幅度不大，20% PEG-6000处理后，优势豆-A-5和杂交豆6号苗期叶片中的SOD活性急剧显著上升，晋豆48的上升幅度较小(图6-A)。
图6 不同浓度PEG-6000处理对杂交大豆苗期叶片抗氧化酶活性的影响
过氧化物酶(POD)作为另一个主要保护酶其活性随着PEG-6000溶液浓度的增加也呈现急剧增强(图6-B)。不同浓度干旱胁迫下，3个杂交大豆苗期叶片中POD活性均显著高于对照。5%PEG-6000处理下，杂交豆6号的增幅最大，其次是优势豆-A-5，晋豆48最低；
10%PEG-6000处理下，3个杂交大豆苗期叶片中POD活性整体增幅均显著高于5%PEG-6000处理，然而20% PEG-6000处理下，其增幅从大到小依次为：晋豆48(237.33%)>杂交豆6号(79.25%)>优势豆-A-5(43.58%)。
2.6 杂交大豆苗期抗旱性综合评价
由2.1～2.5的结果可以看出，杂交大豆抗旱性受不同因素影响，并且同一因素在不同品种间也存在较大差异，很难从单一因素确定3个杂交大豆苗期的抗旱性。同时发现20% PEG-6000胁迫后的各个性状指标明显高于5% PEG-6000和10% PEG-6000，因此笔者采用20% PEG-6000胁迫后的各个指标值，通过隶属函数法来综合评价3个杂交大豆苗期的抗旱性。从表2可以看出，3种杂交大豆的抗旱性从大到小分别为：优势豆-A-5>杂交豆6号>晋豆48，平均隶属函数值分别为0.75，0.47和0.21。
表2 杂交大豆各项抗旱生理指标相对值的隶属函数值
干旱是影响植物正常生长和减少产量的主要环境因素之一，而大豆的抗旱性是一个非常复杂的性状，受多因素影响，不同发育期对抗旱性也存在一定差异，并且可能之间也不存在相关性[15-16]。对于大豆苗期抗旱性研究，前人主要采用盆栽反复干旱法[11,13]，对苗期干旱胁迫后测定生理指标和产量性状，然后进行抗旱性评价。但是本研究在生长间采用PEG-6000水培模式模拟大豆苗期干旱胁迫，通过测定与大豆抗旱性密切相关的光合生理指标、渗透物质含量和抗氧化酶活性等，最后通过隶属函数的方法鉴定3个杂交大豆苗期的抗旱性。相比于前人研究，利用PEG-6000水培模式并且在生长间更容易控制大豆生长环境，减少环境误差，并且利用营养液培养大豆15 d左右生长期操作较为方便。
植物叶片中的叶绿素是光合作用的主要参与者，其含量可以一定程度上反应光合作用强度，从而反应植物生长情况，同时也可反映植物抗逆性的强弱。本研究显示，3个杂交大豆在不同程度干旱胁迫后，其SPAD值的趋势是先变化不显著，后期加大干旱胁迫强度后出现上升趋势，该结果与刘丽平等、王建伟等、马晓华等[17-19]结果一致。说明干旱胁迫后杂交大豆叶片中叶绿素含量升高由可能是由于叶片中叶绿素浓缩效应导致。植物受到干旱胁迫后，其叶片光合作用会受到一定的影响[20]，主要表现在气孔关闭，从而导致植物对二氧化碳和水分的利用率下降，通过测定净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间二氧化碳浓度(Ci)和气孔导度(Gs)等指标来鉴定其影响程度[21-23]。本研究中，随着干旱胁迫的加剧，3个杂交大豆苗期叶片均表现出Pn、Tr、Ci和Gs下降的趋势，这与前人[24-25]研究结果一致。干旱胁迫下，植物叶片的Pn下降应该主要是由于干旱导致叶片组织损伤，从而使光合酶等活性下降。
隶属函数是一种常见的多个影响因子综合评价的方法，其可以避免由单一因素导致分析问题的片面性，从而使评价结果更科学可靠。本研究利用隶属函数值法将影响杂交大豆抗旱性的10个指标进行综合评价，从而筛选出3个杂交大豆抗旱性最好的是优势豆-A-5，其次是杂交豆6号，晋豆48抗旱性较差。并且发现抗旱性最强的是优势豆-A-5，其具体表现在干旱胁迫后光合生理指标(Pn、Gs、Ci和Tr)显著高于其它两个品种，说明优势豆-A-5比其它两个品种具有较强的叶片保水性和光合自身调节能力；
而杂交豆6号抗旱性主要表现在渗透调节物质和抗氧化酶等方面，如可溶性蛋白质含量、脯氨酸含量、SOD和POD活性比其它两个品种高，但是整体抗旱性略逊色于优势豆-A-5。晋豆48干旱胁迫下在叶绿素含量和可溶性糖含量值较高，但是与其它两个品种相比，抗旱性能力差。
本研究利用3个杂交大豆为试验材料进行苗期抗旱性生理响应实验，通过测定叶绿素含量、光合生理指标、渗透调节物含量和抗氧化酶活性等生理指标，并且通过隶属函数值法进行综合评价，得出优势豆-A-5耐旱性最强。该结果为后期抗旱性杂交大豆育种提供数据支撑，并且将优势豆-A-5作为耐旱杂交大豆进行大面积试种和推广。
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