鲍显伟，李小龙，石亚楠，梁晓珊，李 昊，王雪妍，许立华
（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）
牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的一种有包膜、无节段的正链RNA 病毒[1]。该属成员有BVDV-1、BVDV-2、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和边界病病毒（border disease virus，BDV）等[2]。BVDV是导致牛病毒性腹泻（BVD）和黏膜疾病（MD）的病因，可引发病牛繁殖障碍和一系列其他临床表现，如先天性畸形或免疫抑制等[3]。BVDV 能在妊娠早期穿过胎盘而导致胎儿持续感染（PI）。持续感染的动物通常比短暂或急性感染的动物更容易传播BVDV，因其一生中能散播大量病毒，因而被认为是BVDV 的主要宿主[4]。迄今，针对BVD 尚无有效的治疗方法。
牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinortracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV）引起的一种急性、接触性传染病，也称为牛疱疹病毒1 型（bovin eherpes virus 1，BHV-1）。IBRV 属于疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科下的水痘病毒属，是有囊膜的双链线性DNA 病毒[5]。IBR 的主要特征为上呼吸道病症，包括鼻炎、结膜炎、外阴阴道炎、气管炎，还会引起肠炎、流产、脑炎和新生犊牛神经系统感染等[6]。IBRV 感染机体后会引发免疫抑制，诱导引发牛呼吸道综合征（BRDC）[7]。
BVD-MD 和IBR 呈全球性分布，已成为牛的主要传染病。此外，IBRV 和BVDV 是呼吸道疾病复合体的主要病原体，也是导致牛死亡的主要原因[8]。在我国，IBRV 和BVDV 常以单重和混合感染形式存在，因其感染率高，常在血清、鼻拭子和生殖道拭子等样品中被检出。因此建立一种能够同时快速检测IBRV 和BVDV 的双重PCR 方法，对牛群IBR 和BVD 的诊断、流行病学调查和防控具有重要意义。
1.1 病毒阳性核酸
IBRV、BVDV、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytialvirus，BRSV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛细小病毒（bovine parvovirus，BPV）、牛纽布病毒（bovine nebovirus，BNeV）和牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）阳性核酸样品，均由本实验室鉴定并保存。
1.2 主要试剂
病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒等，购自OMEGA 公司；
DL 1 000 DNA Marker、pMD18-T 载体，购自TaKaRa 公司；
HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit，购自Vazyme公司。
1.3 主要仪器
C 1 000 TouchTMThermal Cycler PCR 仪，购自BIO-RAD 公司；
紫外切胶仪，购自上海领成生物科技有限公司；
EPOCH2 microplate reader 酶标仪、凝胶成像仪，购自BioTek 公司。
1.4 样品来源
79 份疑似感染IBRV 和BVDV 的牛血清样品，从宁夏部分规模化牛场采集。
1.5 引物设计与合成
在GenBank 中选取已发表的BVDV（登录号：AB078952.1）和IBRV（登录号：MK654723.1）特异性或保守性序列，分别以BVDV 5"-UTR 和IBRVgB（UL27）基因序列作为靶基因，利用NCBI Primer-BLAST 线上软件设计引物。使用MEGA-X软件对各引物进行互补性分析及对各扩增序列进行同源性分析，通过NCBI BLAST 特异性比对分析，将符合要求的引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及相关信息见表1。
表1 双重PCR 引物信息
1.6 试验方法
1.6.1 IBRV 和BVDV 重组质粒标准品制备分别利用IBRV DNA 和BVDV 总RNA 样品，采用One Step RT-PCR 试剂盒进行反转录和扩增相应目的序列。PCR 反应体系：2×One Step Mix 25.0 µL、One Step Enzyme Mix 2.5 µL、IBRV-F/BVDV-F 2.0 µL、IBRV-R/BVDV-R 2.0 µL、BVDV RNA 或IBRV DNA 样品2.0 µL，最后以RNase free ddH2O 补至50.0 µL。PCR 反应程序：50 ℃30 min，94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 个循环；
72 ℃ 5 min。对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收检测正确的目标条带并纯化；
将产物与pMD18-T 载体连接，转化大肠杆菌细胞（DH5α），接种至氨苄青霉素抗性的LB 固体培养基，37 ℃恒温培养箱培养过夜；
挑取单菌落于氨苄青霉素抗性的LB 液体培养基，37 ℃恒温摇床190 r/min 培养过夜；
进行菌液PCR，对阳性菌液提取质粒；
将重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，对测序结果正确的重组质粒用酶标仪测定浓度，根据相关公式计算拷贝数，并将各阳性质粒分别稀释至107copies/µL（作为阳性对照模板）。
1.6.2 单重PCR 反应条件建立与优化 以各阳性重组质粒为模板，初步建立单重PCR 检测方法，同时设定阴性对照（DEPC 水）。PCR 反应体系：2×One Step Mix 12.50 µL、One Step Enzyme Mix 1.25 µL、BVDV-F 或IBRV-F 0.50 µL、BVDV-R或IBRV-R 0.50 µL、IBRV 或BVDV 阳性质粒模板1.00 µL，最后以RNase free ddH2O 补足至25.00 µL。反应程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 个循环；
72 ℃ 5 min。对退火温度（49.0、49.7、51.1、53.2、55.8、57.8、59.1、60.0 ℃）、引物终浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L）等条件进行优化，根据扩增结果确定最适退火温度和引物终浓度。
1.6.3 双重PCR 反应条件建立与优化 在优化后的单重PCR 反应条件的基础上，初步建立双重PCR 检测方法。将2 种阳性重组质粒等体积混合后作为反应模板。反应体系：2×One Step Mix 12.50 µL、One Step Enzyme Mix 1.25 µL、两 种质粒混合液模板2.00 µL、IBRV-F 和BVDV-F 各1.00 µL、IBRV-R 和BVDV-R 各1.00 µL，最后以RNase free ddH2O 补足至25.00 µL。反应程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，34 个循环；
72 ℃ 5 min。同时对退火温度、引物浓度、模板含量和循环次数等影响因素进行优化，反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带亮度及大小、引物Tm 值等因素，确定最终反应条件和程序。
1.6.4 特异性试验 以等体积混匀的2 种重组质粒作为阳性对照，DEPC 水作为阴性对照，使用建立的双重PCR 方法，对BRSV、BCoV、BPV、BNeV 和M.bovis核酸样品检测，确定方法的特异性。双重PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并记录结果。
1.6.5 敏感性试验 将2 种阳性重组质粒等体积混匀后进行梯度稀释（7 个梯度：107～101copies/µL），使用建立的双重PCR 开展检测，产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并记录结果。
1.6.6 重复性试验 以等体积混匀的2 种重组质粒作为阳性对照，DEPC 水作为阴性对照。使用建立的双重PCR 对每种模板每隔1 周检测1 次，共进行3 次重复性试验。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并记录结果。
1.6.7 临床样品检测 对采集的79 份临床血清样品提取核酸，利用所建立的双重PCR 方法开展检测，并与单重PCR 检测结果比对。对检测结果为阳性的血清样品，按照我国出入境检疫行业标准《牛传染性鼻气管炎聚合酶链反应操作规程》（SN/T 1918—2007）和《牛病毒性腹泻/黏膜病检疫技术规范》（SN/T 1129—2015）中的试验方法进行检测。
2.1 IBRV、BVDV 阳性质粒标准品制备
IBRV、BVDV 克隆质粒分别通过PCR 扩增和电泳，获得500 和198 bp 的目标条带（图1）。对已构建的重组质粒测序，结果与目的基因序列比对一致，表明IBRV 和BVDV 基因片段重组质粒构建成功。将测序正确的阳性质粒分别命名为pMD 18-T-IBRV 和pMD18-T-BVDV。通过测定，两种质粒浓度分别为531.25 和486.86 ng/µL，换算成标准品拷贝数分别为8.88×1011和2.45×1012copies/µL。
图1 IBRV、BVDV 阳性质粒PCR 检测结果
2.2 单重PCR 反应条件优化
对建立的IBRV 和BVDV 单重PCR 反应条件进行优化，最终确定BVDV 单重PCR 反应最佳退火温度为53.2 ℃（图2），最佳引物浓度为0.4 μmol/L（图3）；
IBRV 单重PCR 最佳退火温度为53.2 ℃（图4），最佳引物浓度为0.4 μmol/L（图5）。
图2 BVDV 单重PCR 退火温度优化结果
图3 BVDV 单重PCR 引物浓度优化结果
图4 IBRV 单重PCR 退火温度优化结果
图5 IBRV 单重PCR 引物浓度优化结果
2.3 双重PCR 反应条件优化
利用优化后的单重PCR 体系建立双重PCR，并对该反应条件进行优化。最终确定双重PCR反应体系：2×One Step Mix 12.50 µL、One Step Enzyme Mix 1.25 µL、IBRV-F 和BVDV-F 各1.00 µL、IBRV-R 和BVDV-R 各1.00 µL、pMD 18-T-IBRV和pMD18-T-BVDV 各1.00 µL，最后以RNase free ddH2O 补足至25.00 µL。双重PCR 反应程序：50 ℃30 min，94 ℃ 3 min；
94 ℃ 30 s，53.2 ℃ 30 s，72 ℃25 s，34 个循环；
72 ℃ 5 min。
2.4 特异性试验
利用建立的双重PCR 对IBRV/BVDV、IBRV、BVDV、BRSV、BCoV、BPV、BNeV 和M.bovis核酸样品进行检测。结果（图6）显示，该方法对IBRV/BVDV、IBRV、BVDV 依次扩增出500/198、500 和198 bp 的特异性目标条带，而对BRSV、BCoV、BPV、BNeV 和M.bovis则未扩增出任何片段，表明该双重PCR 方法特异性良好。
图6 双重PCR 特异性试验结果
2.5 敏感性试验
利用DEPC 水将质粒pMD18-T-IBRV 和pMD18-T-BVDV 连续10 倍梯度稀释至101copies/µL，再用该方法对梯度稀释的pMD18-T-IBRV 和pMD18-TBVDV 质粒（107～101copies/µL）进行扩增。结果（图7）显示，对pMD18-T-IBRV 和pMD18-T-BVDV的最低检测限分别为104和103copies/µL，表明建立的双重PCR 方法敏感性较高。
图7 双重PCR 敏感性试验结果
2.6 重复性试验
如图（图8）显示，3 次重复性试验结果一致，均能扩增出相应目标片段，表明建立的双重PCR方法具有较好的重复性。
图8 双重PCR 重复性试验结果
2.7 临床样品检测
为进一步评价双重PCR 的检测效果，对来自宁夏部分地区79 份疑似感染IBRV 和BVDV 的牛血清样品进行检测。结果（表2）显示，IBRV和BVDV 阳性检出率分别为12.66%（10/79）、17.72%（14/79），两种病原混合感染阳性检出率为8.86%（7/79）。该结果与IBRV 和BVDV 单重PCR 检测结果符合率为90.00%和93.33%，两种病原混合感染的阳性符合率为100%。此外，我国出入境检验检疫行业标准试验方法对阳性样品检测结果与双重PCR 一致，表明建立的双重PCR 能较准确地检出IBRV 和BVDV，具有一定临床应用意义。
表2 临床样品检测结果
IBR 和BVD 是牛的两种主要传染病，对我国养牛业造成了重大经济损失。IBRV 和BVDV 常以单重和混合感染的形式存在。BVDV 是RNA 病毒，提取核酸后需反转录成cDNA 进行检测，因操作过程中会增加一定核酸污染风险，因此本研究选择使用DNA/RNA 共提试剂盒提取样品核酸，并利用One step RT-PCR 试剂盒使得反转录和PCR 反应在一管内完成。该试剂对DNA 病毒IBRV 进行PCR扩增时无影响，操作过程中不需额外开管移液，大大提高了检测通量，并降低了污染风险。
本研究利用IBRV 和BVDV 保守基因序列设计特异性引物，通过PCR 反应条件的不断优化，分别建立了IBRV 和BVDV 单重PCR。在此基础上，成功建立了IBRV 和BVDV 双重PCR 检测方法。该方法对IBRV、BVDV 和IBRV/BVDV 均能扩增出特异性条带，对BRSV、BCoV、BPV、BNeV和M.bovis病原核酸扩增结果均为阴性，表明该方法特异性良好。IBRV 和BVDV 的灵敏检测限分别达到了104和103copies/µL，具有较高的敏感性，同时具有良好的重复性。从宁夏部分地区牛养殖场共采集79 份临床疑似IBR 和BVD 症状的奶牛血清样本，采用建立的双重PCR 方法进行检测。试验结果显示，IBRV 和BVDV 阳性率为12.66%和17.72%，两种病原混合感染阳性检出率是8.86%。此外，利用我国对IBRV 和BVDV 出入境检验检疫行业标准试验方法对阳性样品检测，发现其结果与双重PCR 一致。上述结果表明宁夏部分地区规模化牛场存在IBRV 和BVDV 感染，其中BVDV感染率较高，IBRV 次之，同时也存在IBRV 和BVDV 混合感染，这应引起养殖户重视，加强对牛群疫病的防控和监测。
综上，本研究建立的双重PCR 方法可用于临床IBRV 和BVDV 快速检测，为我国对牛群IBR和BVD 诊断和流行病学调查提供了一种快速简便的分子生物学方法，同时也为其防控提供了检测技术支持。
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