何 旭 胡银山 徐孙秋 杨 昆 马春蓉
川北医学院第二临床医学院 四川省南充市中心医院血液内科，四川南充 637000
急性白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是成人急性白血病常见类型之一，占比达20%～30%，尽管近年来AML 诊治取得一定进展，但长期生存率仅为20%～40%[1]。近年来越来越多的研究证实，生物体内长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）等参与AML 发生发展[2-3]。lncRNA-肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）是新近发现的一种lncRNA，研究报道，lncRNA-MALAT-1在颌下腺肿瘤、皮肤癌等恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞恶性进展有关[4-5]。miR-143 是一种高度保守的miRNA，miR-143在甲状腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中异常表达，也与肿瘤细胞恶性进展有关[6-7]。本研究就通过检测AML患者血清中lncRNA-MALAT-1、miR-143 的表达，分析二者与患者临床特征和预后的关系。
1.1 一般资料
选取2017 年1 月至2019 年4 月四川省南充市中心医院（以下简称“我院”）收治的87 例AML 患者为AML 组，其中男47 例，女40 例；
年龄18～84 岁，平均（57.14±8.33）岁；
血红蛋白：51 例≥80 g/L，36 例＜80 g/L；
白细胞计数：42 例≥30×109/L，45 例＜30×109/L；
血小板计数：35 例≥50×109/L，52 例＜50×109/L；
骨髓原始细胞比率：51 例≥70%，36 例＜70%；
髓外病变14 例；
FAB 分型：M1型8 例，M2型39 例，M4型8 例，M5型27 例，M6型5 例；
预后危险分层[8]：高危10 例、中危45 例，低危32 例。另选取32 名同期于我院体检的健康者为对照组，其中男17 名，女15 名；
年龄18～81 岁，平均（56.57±7.19）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准（20170214）。
纳入标准：①经病理检查确诊为AML，符合《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2011 年版）》[9]诊断标准；
②初次确诊；
③临床资料齐全；
④患者及家属知情并签署同意书。
排除标准：①合并骨髓增生异常综合征；
②合并其他部位恶性肿瘤；
③年龄＜18 岁；
④全身性感染性疾病；
⑤不能接受随访；
⑥合并自身免疫性疾病；
⑦急性早幼粒细胞白血病；
⑧入院前接受过抗肿瘤治疗。
1.2 研究方法
收集AML 组入院时和对照组体检时静脉血3 ml，1 500 g 离心15 min 后分离血清，Trizol 法提取血清总RNA，TB Green Premix Ex TaqTM试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司，编号：RR420A-1）逆转录合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 试剂盒（北京百迈客生物科技有限公司，编号：RK02001）说明书进行PCR 扩增，引物设计合成由广州锐博生物技术有限公司完成：lncRNA-MALAT-1，正向引物5’-GCCTGGAAGCTGAAAAACGG-3’，反向引物5’-TGGAAAACGCCTCAATCCCA-3’；
内参GADPH 正向引物5’-CTGACTTCAACAGCGACACC-3’，反向引物5’-GTGGTCCAGGGGTCTTACTC-3’。miR-143 正向引物5’-AGTGCGTGTCGTGGTGT-3’，反向引物5’-GCCTGAGATGAAGCACGTG-3’；
内参U6 正向引物5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。PCR 反应体系共10 μl：cDNA 1 μl，正反向引物各0.5 μl，SYBR Green Master Mix 3 μl，ddH2O 5 μl；
反应条件：95℃90 s，95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循环40 次后进行熔融曲线分析，2-ΔΔCt法计算血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 相对表达量。
1.3 随访
AML 患者入院后参考《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2011 年版）》[9]接受化疗。患者出院后通过门诊或电话随访3 年。
1.4 统计学方法
采用SPSS 28.0 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，组内比较采用配对t检验或F 检验，事后多重比较SNK-q 检验；
计数资料以例数和百分数表示，比较采用χ2检验；
Pearson 相关系数分析AML组血清lncRNA-MALAT-1与miR-143表达的相关性；
Kaplan-Meier 法绘制AML 患者生存曲线，组间生存率Log-rank χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 AML 组与对照组血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达比较
AML 组血清lncRNA-MALAT-1 为（2.12±0.56），高于对照组的（1.10±0.24），miR-143 为（1.01±0.22），低于对照组的（1.59±0.36），差异均有统计学意义（t=13.715、8.610，P＜0.001）。
2.2 AML 组血清lncRNA-MALAT-1 与miR-143 表达的相关性
AML 组血清lncRNA-MAL AT-1 与miR-143 表达呈负相关（r=-0.709，P＜0.001）。
2.3 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达与临床特征的关系
不同白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
不同性别、年龄、血红蛋白、血小板计数、髓外病变、FAB 分型AML患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达与临床特征的关系（）
表1 AML 患者血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达与临床特征的关系（）
注 与低危比较，aP＜0.05；
与中危比较，bP＜0.05。AMI：急性髓系白血病；
lncRNA-MALAT-1：长链非编码RNA-肺腺癌转移相关转录本1；
miRNA：微RNA
2.4 血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达与AML患者预后的关系
87 例AML 患者随访4～36 个月，中位随访26 个月，失访6 例，死亡39 例，3 年总生存率为55.17%（48/87）。根据血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达均值分为lncRNA-MALAT-1 高表达组（≥2.12，45 例）、miR-143高表达组（≥1.01，43 例）和lncRNA-MALAT-1 低表达组（＜2.12，42 例）、miR-143 低表达组（＜1.01，44 例）。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，lncRNA-MALAT-1 高表达组3 年总生存率为40.00%（18/45），低于lncRNA-MALAT-1 低表达组的71.43%（30/42）；
miR-143 高表达组3 年总生存率为67.44%（29/43），高于miR-143 低表达组的43.18%（19/44），差异有统计学意义（Log-rank χ2＝10.295、7.338，P＝0.001、0.007）。见图1。
图1 不同血清lncRNA-MALAT-1、miR-143 表达AML 患者Kaplan-Meier 生存曲线
AML 是起源于造血干细胞的恶性肿瘤，由造血干细胞或祖细胞中特定细胞转录、表观遗传、点突变、遗传突变等变化转变形成[10-11]。目前国际上对AML 已有较统一的系统治疗方案，完全缓解率可达70%～90%，但仍有20%的患者难以达到完全缓解，且大多AML 患者完全缓解后可再次复发，发展为复发性难治性AML[12-13]。因此还需进一步深入探索AML 相关调控机制。
LncRNA 是一类转录本＞200 个核苷酸的非编码RNA，能直接参与基因调控，也能通过海绵miRNA 间接调节miRNA 相关靶基因表达[14]。lncRNA-MALAT-1定位于人染色体11q13.1，最初于非小细胞肺癌中发现，因此多数学者致力于研究其在不同肿瘤中的作用[15]。Ferri 等[16]研究报道，lncRNA-MALAT-1 能海绵miR-423-5p 促进前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。阿小英等[17]研究报道，lncRNA-MALAT-1 能海绵miR-124-3p上调信号转导和转录激活因子3 促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。本研究结果显示，AML 组血清lncRNAMALAT-1 高表达，且不同白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层的AML 患者血清miR-143 表达存在差异，提示lncRNA-MALAT-1 高表达参与了AML 进展。lncRNA-MALAT-1 在AML 中高表达可能与转录过程中Sp1 通过结合启动子激活和促进lncRNA-MALAT-1转录有关[18]。随着lncRNA-MALAT-1表达上调，能通过上调C-X-C 基序趋化因子受体4表达促进AML 细胞增殖、迁移和抑制凋亡[19]。同时lncRNA-MALAT-1 表达上调也能通过与上皮转化生长因子β 相互作用诱导肿瘤细胞上皮间质转化，促进肿瘤进展[15]。
miR-143 定位于人染色体5q32，在心脏、骨骼、血管等多种组织细胞中均有表达，最初研究局限于其在心脑血管和炎症中的作用，近年研究发现，miR-143还参与肿瘤相关过程[20-21]。Xu 等[22]研究报道，miR-143能靶向缺氧诱导因子-1α 相关的葡萄糖转运蛋白1通路，抑制乳腺癌细胞增殖和迁移。Han 等[23]研究报道，miR-143 能靶向DNA 甲基转移酶3α 降低卵巢癌细胞对顺铂耐药性，促进卵巢癌细胞凋亡。本研究结果显示，AML 组血清miR-143 低表达，且不同白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层的AML 患者血清miR-143 表达存在差异，提示miR-143 低表达参与了AML 进展。miR-143 在AML 中低表达可能与miR-143 启动子甲基化有关[24]。同时miR-143 低表达能通过上调己糖激酶2 促进AML 细胞糖酵解，通过增强AML 细胞能量代谢促进其迁移和侵袭[25]。进一步分析发现，AML 患者血清lncRNA-MALAT-1 与miR-143 表达呈负相关，说明二者可能共同参与AML 进展。黄劲龙等[26]通过双荧光素酶报告实验证实，过表达lncRNA-MALAT-1 能抑制miR-143 表达，与AML 细胞增殖和凋亡抑制相关。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，与lncRNA-MALAT-1 高表达和miR-143 低表达相比，lncRNA-MALAT-1 低表达与miR-143 高表达的AML 患者3 年总生存率升高，提 示lncRNA-MALAT-1、miR-143 与AML 患者预后密切相关。
综上所述，AML 患者血清lncRNA-MALAT-1 高表达和miR-143 低表达，与白细胞计数、骨髓原始细胞比率、预后危险分层和预后有关。但本研究结果还需更多样本量和更长的随访时间进一步证实，并进一步验证lncRNA-MALAT-1、miR-143 参与AML 进展的机制。
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