马永，赵斌，王明岗，金爱莲*
（1商丘市第一人民医院全科医学科，商丘 476000；
2商丘市第一人民医院检验科，商丘 476000；
3商丘市第一人民医院心内科，商丘 476000；
4商丘市第一人民医院心脏重症监护室，商丘 47600）
冠心病是威胁人类生命健康的主要疾病之一。冠心病病情加重可导致心肌梗死、脑卒中等不良心血管事件的发生[1]。目前研究发现，炎症、氧化应激及心肌细胞凋亡与冠心病发生发展关系密切[2]。核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）激活后可进入细胞核，与抗氧化元件（antioxidant response element，ARE）结合，影响缺氧诱导因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）及抗氧化、抗炎相关因子表达，来参与细胞应激性损伤及凋亡过程，而有望成为冠心病治疗的新靶点[3,4]。
决明子蒽醌苷（anthraquinone glycoside from cassia, AQGC）是决明子中的主要有效成分。近来临床报道发现，其对非酒精性脂肪肝病[5]、高血压及心肌损伤[6]患者有较好的疗效，由此提示AQGC也可能是缓解冠心病进一步发生发展的潜在药物。本研究建立大鼠冠心病模型，对此进行探究验证，以期为AQGC的临床推广及应用，奠定实验及理论基础。
1 材料
SD大鼠70只，雄性，健康，清洁级，体重200～220 g，购自安徽丰原药业股份有限公司，批号：SYXK（皖）2020-003。所有大鼠于本院动物房中饲养。本研究经本院动物伦理委员会批准同意，批号为IACUC-01（20201017）。AQGC（批号：20200211004，陕西元朗生物工程有限公司）；
脂肪乳（货号：rc1020，上海热创生物技术有限公司）；
维生素D3（货号：30056387，深圳海思安生物技术有限公司）；
垂体后叶素（货号：TJ8199，杭州肽佳生物科技有限公司）；
Nrf2抑制剂-全反式维甲酸（ATRA）（货号：302-79-4，上海联硕生物科技有限公司）；
缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF-1α）抑制剂-2-甲氧雌二醇（2ME2）（货号：T2220，南京赛泓瑞生物科技有限公司）；
HE及TUNEL染色试剂盒（货号：SY2022，YT2205，北京伊塔生物科技有限公司）；
总胆固醇ELISA试剂盒（货号：YS04424B，上海雅吉生物科技有限公司）、活性氧簇（ROS）ELISA试剂盒（货号：R32034，上海圻明生物科技有限公司）、丙二醛（MDA）ELISA试剂盒（货号：lisa385，上海广锐生物科技有限公司）；
兔源Nrf2（货号：ab31163）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）（货号：ab138491）、超氧化歧化酶2（SOD2）（货号：ab68155）、内脂素（visfatin）（货号：ab236873）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（货号：ab109322）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）（货号：ab181095）、白细胞介素-18（IL-18）（货号：ab191860）、HIF-1α（货号：ab179483）、E1B相互作用蛋白3（BNIP3）（货号：ab109362）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）（ab179515）抗体和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（货号：ab6721）均购自英国Abcam公司。
2 大鼠冠心病模型建立及分组处理
参照文献[7]方法，取大鼠每日腹腔注射60万单位 / kg的维生素D3+灌胃10 mL / kg的脂肪乳，连续12周，建立大鼠冠心病模型，造模结束前3 d，每日腹腔注射30万单位 / kg垂体后叶素，共3次后，用心电图检测PR段基线J点位移，以J点变化幅度超过0.1 mV，视为造模成功，共造模成功50只（10只未成功），随机分为模型组、AQGC组、Nrf2抑制剂组、AQGC+Nrf2抑制剂组和缺氧诱导因子（HIF-1α）抑制剂组，每组10只；
另取10只健康大鼠，在相同时间条件下灌胃及注射生理盐水，作为正常对照组。
AQGC组参照文献[5]经腹腔注射给药20 mg /kg，1次 / d，连续2周；
Nrf2抑制剂组根据文献[8]经腹腔注射7 mg / kg的Nrf2抑制剂-全反式维甲酸（ATRA），2次 / d；
HIF-1α抑制剂组参照文献[9]经腹腔注射15 mg / kg的HIF-1α抑制剂-2-甲氧雌二醇（2ME2），2次/ d；
AQGC+Nrf2抑制剂组同时腹腔注射Nrf2抑制剂及AQGC进行干预；
模型组及对照组给予等剂量的生理盐水进行干预。
3 超声心动图检测心功能变化
各组大鼠给药结束后，用超声心动图检测心功指标左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS），以评价心功能变化。
4 ELISA法检测总胆固醇及心肌组织氧化应激产物
麻醉大鼠后，取腹主动脉血2 mL，按ELISA试剂盒法检测血清总胆固醇水平。断头处死大鼠，解剖取心脏组织，剪取心尖组织约0.5 g，机械粉碎匀浆后，取匀浆液，按ELISA试剂盒法测氧化应激产物ROS及MDA水平。剩余心肌组织分成两部分，一部分置于-80 ℃保存备用，另一部分迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后，制成5 μm的石蜡切片，备用。
5 HE及TUNEL染色观察大鼠心肌组织损伤及凋亡状况
取心肌组织石蜡切片，脱蜡水化及抗原修复处理后，按HE及TUNEL染色液说明书方法染色处理后，置于光学显微镜下观察拍照。TUNEL染色切片随机取5个视野，以Image-Pro Plus 6.0软件分析每视野下凋亡细胞（阳性染色为红棕色）数目，根据公式凋亡率=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%，计算细胞凋亡率。
6 免疫组织化学染色
取相同部位心肌组织切片，脱蜡、脱水、透化后，在4 ℃孵育盒中滴加1∶100的抗Nrf2一抗（1∶100）孵育过夜，HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶1000）室温孵育及DAB显色后，光镜下观察拍照，每个切片随机取5个视野，Image-Pro Plus 6.0软件分析每视野下Nrf2免疫反应性（平均光密度值）。
7 Western blot
取冰冻心肌组织，4 ℃解冻及机械匀浆处理后，取匀浆液，提取胞质及胞核蛋白，BCA法测蛋白浓度，取80 μg蛋白样品行电泳及转膜处理，加入1 ∶ 1200 的 Nrf2、GST、SOD2、visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18、HIF-1α、BNIP3、Caspase-1 一抗抗体，及1∶1500的内参蛋白β-actin一抗抗体，4 ℃孵育过夜后，加入1∶1000的HRP标记的羊抗兔二抗溶液，室温孵育1.5 h后，发光试剂盒法显色，化学发光仪采集照片，Image-J软件分析蛋白条带光密度，以各目的蛋白条带光密度值与内参蛋白条带光密度值的比值为相应目的蛋白相对表达水平。
8 统计学分析
SPSS22.0软件统计分析数据，平均数±标准差（±s）表示符合正态分布的数据，两组比较、组间比较及组间多重比较，分别用t检验、单因素方差分析及snk-q检验。
1 Nrf2抑制剂阻断决明子蒽醌苷对冠心病大鼠心功能损伤的改善
与正常对照组相比，模型组大鼠心功能 LVEF及LVFS降低；
与模型组相比，AQGC组及HIF-1α抑制剂组大鼠LVEF及LVFS升高；
Nrf2抑制剂组LVEF及LVFS进一步降低；
与AQGC组相比，决明子+Nrf2抑制剂组LVEF及LVFS降低（表1）。
表1 决明子蒽醌苷和Nrf2抑制剂对冠心病大鼠心功能影响的统计学分析Tab.1 Statistical analysis for the effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on cardiac function of rats with coronary heart disease
2 Nrf2抑制剂阻断决明子蒽醌苷对冠心病大鼠心肌组织损伤及细胞凋亡的抑制
正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐、染色均匀，无炎性浸润；
模型组大鼠心肌细胞肥大、胞质染色不均匀、胞核变形，细胞间间隙变宽，心肌纤维萎缩且排列紊乱，炎症细胞浸润明显，TUNEL染色可见红棕色阳性染色的凋亡细胞比例明高于正常对照组；
AQGC组及HIF-1α抑制剂组心肌组织细胞上述病理损伤较模型组减轻，细胞凋亡率低于模型组；
Nrf2抑制剂组心肌组织细胞上述病理损伤最严重，细胞凋亡率较模型组升高；
与AQGC组相比，AQGC+Nrf2抑制剂组心肌组织细胞损伤严重，心肌细胞凋亡升高（图1，表2）。
表2 决明子蒽醌苷和Nrf2抑制剂对冠心病大鼠心肌组织细胞凋亡率影响的定量分析Tab.2 Quantitative analysis for the effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on apoptosis rate in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease
3 Nrf2抑制剂阻断决明子蒽醌苷对冠心病大鼠血脂及心肌组织氧化应激产物的降低
与正常对照组相比，模型组大鼠血脂-血清总胆固醇水平、心肌组织氧化应激产物ROS及MDA水平升高；
与模型组相比，AQGC组及HIF-1α抑制剂组大鼠血清总胆固醇水平、心肌组织ROS及MDA水平降低；
Nrf2抑制剂组血清总胆固醇水平、心肌组织ROS及MDA水平进一步升高；
与AQGC组相比，AQGC+Nrf2抑制剂组血清总胆固醇水平、心肌组织ROS及MDA水平升高（表3）。
4 Nrf2抑制剂阻断决明子蒽醌苷对冠心病大鼠Nrf2及其下游抗氧化应激蛋白表达的上调
免疫组织化学染色显示，模型组大鼠心肌组织细胞中Nrf2呈强阳性表达。与正常对照组相比，模型组大鼠心肌组织Nrf2阳性表达、蛋白表达均升高，其下游抗氧化酶活性蛋白GST及SOD2表达降低；
与模型组相比，AQGC及HIF-1α抑制剂组大鼠Nrf2表达进一步升高，其下游抗氧化酶活性蛋白GST及SOD2表达升高；
Nrf2抑制剂组Nrf2及GST及SOD2表达降低。与AQGC组相比，AQGC+Nrf2抑制剂组Nrf2及GST及SOD2表达降低（图2，表4）。
表4 决明子蒽醌苷和Nrf2抑制剂对冠心病大鼠心肌组织Nrf2及其下游抗氧化应激蛋白表达影响的定量分析Tab.4 Quantitative analysis for the effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of Nrf2 and its downstream antioxidant stress proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease
图2 决明子蒽醌苷和Nrf2抑制剂对冠心病大鼠心肌组织Nrf2及其下游抗氧化应激蛋白表达的影响。A，Nrf2表达的代表性免疫组织化学检测；
比例尺，100 μm。B，Nrf2、SOD、GST水平的代表性Western blot检测Fig.2 Effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of Nrf2 and its downstream antioxidant stress proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease.Scale bar, 100 μm
5 Nrf2抑制剂阻断决明子蒽醌苷对冠心病大鼠心肌组织炎性反应相关蛋白表达的下调
与正常对照组相比，模型组大鼠心肌组织visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18蛋白表达升高；
与模型组相比，AQGC组及HIF-1α抑制剂组大鼠visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18表达降低；
Nrf2抑制剂组大鼠心肌组织visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18蛋白表达进一步升高。与AQGC组相比，AQGC+Nrf2抑制剂组大鼠visfatin、TNF-α、MCP-1、IL-18蛋白表达升高（图3）。
图3 决明子蒽醌苷和Nrf2抑制剂对冠心病大鼠心肌组织炎性反应相关蛋白表达的影响。A， visfatin、TNF-α、MCP-1和IL-18水平的代表性Western blot检测；
B—E，visfatin、TNF-α、MCP-1和IL-18水平的统计学分析；
与正常对照组相比，aP＜0.05；
与模型组相比，bP＜0.05；
与AQGC组相比，cP＜0.05；
n=10Fig.3 Effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of inflammatory response-related proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease; A, representative Western blot detection of levels of visfatin, TNF-α, MCP-1 and IL-18; B to E, statistical analysis of levels of visfatin, TNF-α, MCP-1 and IL-18; aP＜0.05, compared with the normal control group; bP＜0.05, compared with the model group;cP＜0.05, compared with AQGC group; n=10
6 Nrf2抑制剂阻断决明子蒽醌苷对冠心病大鼠心肌组织凋亡通路相关蛋白表达的下调
与正常对照组相比，模型组大鼠心肌组织HIF-1α、BNIP3、caspase-1蛋白表达升高；
与模型组相比，AQGC组及HIF-1α抑制剂组大鼠HIF-1α、BNIP3、caspase-1表达降低；
Nrf2抑制剂组大鼠心肌组织HIF-1α、BNIP3、caspase-1蛋白表达进一步升高。与AQGC组相比，AQGC+Nrf2抑制剂组大鼠HIF-1α、BNIP3、caspase-1蛋白表达升高（图4）。
图4 决明子蒽醌苷和Nrf2抑制剂对冠心病大鼠心肌组织凋亡通路相关蛋白表达的影响。A， HIF-1α、BNIP3和caspase-1水平的代表性Western blot检测；
B—D，HIF-1α、BNIP3和caspase-1水平的统计学分析；
与正常对照组相比，aP＜0.05；
与模型组相比，bP＜0.05；
与AQGC组相比，cP＜0.05；
n=10Fig.4 Effect of anthraquinone glycoside from cassia and Nrf2 inhibitor on the expression of apoptosis pathway-related proteins in the myocardial tissue of the rats with coronary heart disease; A, representative Western blot detection of levels of HIF-1α, BNIP3 and caspase-1; B to D, statistical analysis of levels of HIF-1α, BNIP3 and caspase-1; aP＜0.05, compared with the normal control group; bP＜0.05, compared with the model group; cP＜0.05,compared with AQGC group; n=10
冠心病常由血脂沉积、冠脉狭窄等引起的心肌缺血缺氧性损伤[10]。缺血缺氧诱导心肌组织坏死的同时，也会诱导巨噬细胞浸润并释放促炎因子而导致组织应激性损伤[11]。本研究用脂肪乳灌胃+注射维生素D3模拟血脂沉积及冠脉狭窄法复制冠心病模型后发现，大鼠血脂-总胆固醇升高的同时，还随着心功能下降，心肌细胞变形、炎症浸润及凋亡等病理损伤现象，提示造模成功。决明子中的提取物蒽醌苷对血脂有调节作用[12]，决明子蒽醌苷（AQGC）还可对酒精性脂肪肝病具有一定的治疗效果[13]。且宋云梅[14]发现AQGC对糖尿病引发的肾损伤和心肌损伤有较好的改善作用。另外，李玉晶[5]及于海荣[6]等临床报道发现AQGC对脂肪肝病和高血压等引起的肝损伤和心肌细胞损伤等有较好的改善作用。本研究给予冠心病模型大鼠一定剂量的AQGC进行干预治疗后，发现大鼠血脂指标-总胆固醇降低，心功能下降，心肌细胞变形、炎症浸润及凋亡等病理损伤明显缓解，证实AQGC对冠心病有潜在的治疗作用。本研究对其治疗作用的相关机制，进行进一步探究。
炎性及氧化应激反应，均可导致心肌细胞及动脉内皮细胞释放大量氧自由基，并导致清除氧自由基的酶如SOD活性降低，氧自由基蓄积后与细胞膜上不饱和脂肪酸反应而产生MDA，来破坏细胞膜结构和功能，引发冠心病的进一步发展[15,16]。易德茂等[17]发现冠心病患者血清SOD降低，氧自由基ROS及氧化应激产物MDA水平明显高于正常健康人群，并认为提高SOD活性，可有效清除ROS及MDA水平，提高患者抗氧化应激损伤。Zheng等[18]发现，内脏脂肪细胞分泌的新型脂肪细胞因子visfatin，可通过促进炎症通路-核转录因子κB（NF-κB）活化，来促进TNF-α、MCP-1分泌，引起ROS释放效应扩大，微血管堵塞加重，最终导致冠心病患者缺氧恶化。本研究也在冠心病模型大鼠心肌组织中检测到visfatin、TNF-α、MCP-1、ROS及MDA水平的升高，SOD抗氧化活性的降低，进一步证实造模成功。
Nrf2是调控机体抗氧化应激、抗炎反应的关键通路。文献研究证实，Nrf2可与ARE结合，上调抗氧化酶GST及SOD2等活性，来抑制内源性和外源性ROS导致的细胞损伤；
另外，Nrf2还可激活细胞内的保护程序，抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体活化，降低细胞内caspase-1和IL-18等的成熟分泌，来抵抗炎症反应[19]。近来也有研究发现，Nrf2活性的改变，也可诱导HIF-1α表达，来上调促凋亡蛋白如BNIP3表达而介导细胞凋亡。Baba等[20]研究发现HIF-1α升高，可通过抑制Maf与Nrf2的结合，而抑制Nrf2的活性，来启动细胞凋亡程序。郭坤等[7]发现，抑制HIF-1α表达，可降低促凋亡细胞因子BNIP3表达，来改善冠心病大鼠心肌组织炎症反应及凋亡水平。
本研究发现，冠心病模型大鼠心肌组织抗氧化酶GST及SOD2活性降低，Nrf2呈代偿性升高，HIF-1α及BNIP3促细胞凋亡因子表达也随之升高，用Nrf2抑制剂抑制Nrf2活性后，HIF-1α-BNIP3促凋亡活性进一步升高，Nrf2下游抗氧化酶GST及SOD2活性进一步降低，促炎反应IL-18表达进一步升高，大鼠表现出更为严重的心功能下降及心肌损伤凋亡现象，反之给予HIF-1α抑制剂阻断HIF-1α-BNIP3促凋亡反应的同时，Nrf2及其下游抗氧化酶活性升高，IL-18炎性反应减弱，大鼠心功能下降及心肌损伤凋亡现象得到显著改善，提示Nrf2通路活化在冠心病心肌氧化应激、炎症反应及凋亡过程中发挥保护作用，抑制Nrf2活化，可加重冠心病的发展，阻断HIF-1α活化，可促进Nrf2活化发挥保护作用。AQGC组大鼠心肌组织细胞中Nrf2活性被促进，HIF-1α-BNIP3促凋亡活化被抑制，Nrf2调控的抗氧化酶活性、抗炎反应被激活，提示AQGC改善冠心病大鼠心肌氧化应激、炎性反应损伤及凋亡作用，可能与促进Nrf2活化有关。AQGC与Nrf2抑制剂联合应用后，AQGC的促进Nrf2活化、改善冠心病大鼠心肌氧化应激、炎性反应损伤及凋亡等作用被削弱，进一步证实AQGC可通过促进Nrf2活化，发挥抗炎、抗氧化应激及抗凋亡作用，来改善冠心病大鼠病理症状。
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