马丽娜·阿新拜，陈 阳，梅拉·哈万，库丽夏西·马尼，古丽加娜·奴尔包拉提，兰 卫△
（1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830000；
2.新疆阿勒泰地区哈萨克医医院，新疆 阿勒泰 836300）
世界卫生组织于1998年首次定义代谢综合征（MetS）[1］，并将胰岛素抵抗（IR）、肥胖、血脂异常和高血压联系起来。MetS与表现为慢性低度炎症状态的2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、心肌梗死和中风的风险增加有关，其为全球性健康问题，是全世界心脑血管病发病率和死亡率攀升的主要原因。MetS具有腹型肥胖和IR这2个主要临床特征，而IR作为核心发病机制，与其他代谢危险因子的增加密切相关[2］。IR是慢性亚临床炎症过程，相互影响的胰岛素信号通路和炎性信号通路共同构成了IR复杂的机制网络。因此，IR和炎性反应是MetS的核心机制。柯孜木克颗粒（以下简称KZMK）由沙生蜡菊、黑果越橘、木贼组成，是哈萨克族民间经验方。有研究证实，KZMK能明显改善模型小鼠急慢性炎症，抑制内源性介质前列腺素E2及5-羟色胺的释放[3-4］。本研究中采用高盐高糖高脂饲料喂养雄性SD大鼠以建立Mets模型，探讨KZMK减轻炎性反应的作用及机制，为该制剂改善MetS提供理论证据。现报道如下。
1.1 仪器、试药与动物
仪器：Eppendorf 5417R型台式低温高速离心机（Eppendorf中国有限公司）；
LEICA RM2135型石蜡切片机（德国Leica公司）；
BX53型光学显微镜（日本Olympus公司）；
Olympus IX71型倒置荧光显微镜（苏州景通仪器有限公司）。
试药：KZMK（新疆阿勒泰地区哈萨克医医院药房，组方：沙生蜡菊384 g、黑果越橘115 g、木贼192 g）。盐酸二甲双胍片（北京索莱宝科技有限公司，批号为404I021，纯度≥98.0%）；
高盐高脂高糖饲料（江苏美迪森生物医药有限公司，成分为0.5%胆盐、5%食用盐、10%果糖、10%奶粉、2%胆固醇、10%蛋黄粉、10%熟猪油、52.5%基础饲料，批号为MD1203）；
核因子κB（NFκB）P65抗体（美国Affinity Biosciences公司，批号为DF7003）；
SP超敏免疫组化试剂盒（兔SP试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为SP9001）；
肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号为ml077385）；
苏木素-伊红（HE）染液（武汉Servicebio公司，批号为G1005）。
动物：SD大鼠，雄性，6～8周龄，体质量（180±20）g，由新疆医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号SYXK（新）2018-0003。于新疆医科大学动物房饲养，自由饮水，温度19～24℃，相对湿度60%～70%，12 h交替光照，适应性喂养1周。
1.2 方法
1.2.1 分组与建模
将36只SD大鼠随机分为正常组（等体积生理盐水），模型组（等体积生理盐水），KZMK高、中、低剂量组（70.38，35.19，17.6 mg/kg），以及二甲双胍组（3 mg/kg），各6只。正常组饲以普通饲料，其余组均饲以高盐高脂高糖饲料[5-6］12周，以建立MetS大鼠模型。8周后，各组大鼠灌胃给予相应药物或生理盐水（灌胃体积10 mg/kg），每日1次，连续4周。末次给药后12 h禁食不禁饮，腹腔注射10%水合氯醛溶液以麻醉大鼠，腹主动脉取血5 mL，静置1 h后，4℃3000 r/min离心15 min，分离上层血清。
1.2.2 观察指标
血清TNF-α水平：取大鼠血清，采用ELISA法检测，严格按相应试剂盒说明书操作。
肝脏组织病理形态：取大鼠肝脏，在距离边缘1.0 cm处切取肝组织（0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm），置4%多聚甲醛溶液；
剩余肝组织切成若干块，用冻存管-80℃保存。取多聚甲醛溶液中保存的肝组织，常规脱水，石蜡包埋后，采用石蜡切片机连续切4μm厚片。脱蜡，HE染色后以中性树胶（50μL）封片，显微镜下观察并拍照。
NF-κB表达水平：采用免疫组织化学法。取大鼠肝脏组织，固定，脱水，切片，滴加兔抗大鼠NF-κBp65抗体，4℃过夜，再滴加二抗，DAB显色、贴片、脱水、透明、封片，在倒置荧光显微镜下观察并拍照；
采用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，测定平均光密度值。
1.3 统计学分析
采用SPSS19.0统计学软件分析。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，以LSD-t检验进行多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 大鼠肝脏组织病理形态
正常组大鼠的肝脏组织形态正常，特点是肝小叶结构完整清晰，肝细胞索整齐，无肿胀和炎性细胞浸润。模型组大鼠肝小叶结构不清晰，肝细胞松散、肿胀、紊乱，肝脏脂肪变性明显，炎性细胞浸润。KZMK低剂量组大鼠肝小叶略微完整，肝细胞肿胀较少，炎性细胞浸润较少；
KZMK中剂量组大鼠的肝小叶结构较模型组明显改善，肝细胞肿胀减少；
KZMK高剂量组大鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞索有序，无明显肝细胞肿胀。二甲双胍组肝组织形态介于模型组与KZMK各剂量组之间，脂肪变性少见。详见图1。
图1 大鼠肝脏组织病理形态（HE，×200）A.Normal group B.Model group C.Metformin group D.KZMK lowdose group E.KZMK medium-dose group F.KZMK high-dose groupFig.1 Histopathological morphology of liver in rats（HE，×200）
2.2 大鼠血清TNF-α水平
实验结束时，各组所剩大鼠只数不一。与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α水平有所升高；
与模型组比较，KZMK各剂量组大鼠血清TNF-α水平均显著降低（P＜0.05）。详见表1。
2.3 大鼠肝脏组织NF-κB表达水平
与正常组比较，模型组大鼠肝脏组织NF-κB表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，KZMK各剂量组NF-κB表达水平均显著降低（P＜0.05）。详见表1。
表1 各组大鼠血清TNF-α及肝脏组织NF-κB水平比较（±s）Tab.1 Comparison of TNF-αlevel in serum and NF-κB level in liver tissue of rats in each group（±s）
表1 各组大鼠血清TNF-α及肝脏组织NF-κB水平比较（±s）Tab.1 Comparison of TNF-αlevel in serum and NF-κB level in liver tissue of rats in each group（±s）
注：与正常组比较，#P＜0.05；
与模型组比较，*P＜0.05。Note：Compared with those in the normal group，#P＜0.05；
Compared with those in the model group，*P＜0.05.
组别正常组（n=6）模型组（n=3）二甲双胍组（n=4）KZMK低剂量组（n=6）KZMK中剂量组（n=5）KZMK高剂量组（n=5）F值P值剂量（mg/kg）3.0 17.6 35.19 70.38 TNF-α（ng/mL）0.63±0.01 0.67±0.02 0.63±0.03 0.57±0.07*0.60±0.06*0.56±0.04*8.559 0.019 NF-κB 136.53±13.53 152.49±10.82#137.56±6.36 137.54±2.94*137.32±7.12*137.17±13.74*1.281 0.306
据估计，全世界有20%～30%成年人患有MetS[7］，且发病年龄趋于年轻化。近年来，我国的MetS患病率（19.58%～33.9%）与世界水平持平[8］。现代社会以久坐的生活方式为特点，加之人们缺乏体育活动，尤其是饮食习惯的改变，导致MetS的发病率不断上升[9］。因此，MetS的预防和治疗至关重要。MetS是多系统病理生理过程的集合体，而不是单一的疾病实体，它是由环境因素、遗传因素及慢性全身性炎性状态相互作用引发的一组临床症候群[10］。具体而言，存在腰围增加、高甘油三酯血症（＞150 mg/dL或已开始药物治疗）、低高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）血症（＜40mg/dL或已开始药物治疗）、血压升高（收缩压＞130 mmHg和/或舒张压＞85mmHg，或已开始抗高血压治疗）、空腹血糖升高（＞100 mg/dL或已开始药物治疗）中的3个因素即为MetS[11］。
MetS的组分共同增加了罹患心血管疾病、2型糖尿病、肝脂肪变性和肥胖相关癌症等疾病的风险。同时MetS是全身性系统性的低度炎症状态。因此，慢性全身炎症状态与MetS相关，且起着介导IR的作用[12］。脂肪细胞中的脂肪组织由于脂质大量积累而不断肥大，由于组织和细胞应激及缺氧，从而引起脂肪细胞坏死，同时巨噬细胞浸润，分泌TNF-α、白细胞介素（IL）-6等促炎性介质，其引发的局部炎症会扩散成全身炎症[12］，同时诱导脂肪细胞和周围组织中的IR[13］。总而言之，当机体出现MetS时，TNF-α、IL-6等炎性因子水平可能会相应升高[14］。前期研究证实以高盐高脂高糖饲料喂养SD大鼠8周可复制MetS大鼠模型，该模型存在明显的IR、糖脂代谢紊乱，在病因学、全身疾病背景方面均与人类MetS发病极为相似，是研究MetS发病机制较理想的一种动物模型。同时，早期监测TNF-α等炎性因子水平，能及早发现并干预MetS及相关系统性疾病[15］。本研究中发现，与模型组相比，KZMK各剂量组大鼠肝组织肝小叶结构改善，肝细胞肿胀程度减轻，炎性细胞浸润减少，脂肪泡减少，说明KZMK能改善MetS模型大鼠肝脏组织病理形态；
与模型组比较，KZMK各剂量组血清TNF-α水平均显著降低，说明KZMK能降低MetS模型大鼠炎性因子水平，改善其炎症状态。
MetS的特点是慢性低度炎症状态，其起因是各种炎症信号通路的激活，导致NF-κB、Jun N-末端激酶和炎症小体的激活，这些通路汇聚到一起，减少胰岛素信号转导，并在代谢组织中诱导炎性反应。激活的NF-κB进入细胞核后，与炎症基因的转录起始区进行特异性结合，启动转录，介导TNF-α、IL-1等炎性因子的释放[16］。NF-κB信号可诱导大量炎症趋化因子、细胞因子的产生，由此形成低度炎症环境。NF-κB的活化对TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6等炎性因子的产生是必需的，NF-κB激活后，促进上述因子转录，使其大量合成并加速分泌。同时TNF-α又使NF-κB活化，活化后的NF-κB进入细胞核，如此往复，加剧组织和细胞的炎性损伤[17］。因此，对于MetS的防治，炎症启动因素的控制及炎性因子之间平衡的恢复至关重要[18］。抑制NF-κB的活化或降低NF-κB水平很可能有助于改善MetS炎性状态。本研究中，与模型组比较，各给药组大鼠肝脏组织NF-κB表达水平均降低，即发挥了抑制NF-κB活化的作用，在一定程度上抑制MetS模型大鼠炎性反应，有利于MetS的防治。
MetS的最佳治疗方法是改变生活方式，但对患者来说难度较大，故还需配合药物治疗。西医主要使用胰岛素增敏剂、他汀类药物、肾素-血管紧张素系统（RAS）受体阻滞剂等，常见副作用包括体质量增加、胰岛素敏感性降低、体液潴留、影响骨骼等。中医药方面，柴芪汤[7，19-20］、小柴胡汤[21］、黄连温胆汤[22］等均为长期用于临床治疗MetS的方剂。KZMK中沙生蜡菊盛产于新疆，杨金香等[23］研究发现，其中的芹菜素可作用于不同信号通路，抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的产生，进而减轻肝脏炎性病变；
黑果越橘属新疆特色药材，其能增强胰岛素敏感性，激活肝脏一磷酸腺苷（AMP）依赖性蛋白激酶，抑制葡萄糖产生，进而改善IR[24］；
木贼别名接骨草，姜秀娟等[25］发现其能减轻非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞炎性反应，改善其肝脏功能。综上所述，KZMK能通过抑制NF-κB的活化，减少TNF-α的产生，改善炎性状态及肝组织病变程度，有利于MetS的防治。
本研究中，KZMK在一定程度上可改善MetS模型大鼠肝脏组织肝小叶结构，缓解肝细胞肿胀，减少炎性细胞浸润，进而改善肝脏组织病理形态。同时对MetS模型大鼠肝脏组织中NF-κB的活化有一定的抑制作用。本研究为KZMK用于MetS的防治提供了理论证据。下一步将加大样本量、延长用药疗程进一步研究该药的治疗机制。
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