高明朗，赖 凯，邓 宇，卢子龙，徐宸桢，王文捷，李 宁，耿 庆
（武汉大学人民医院胸外科，湖北 武汉 430060）
最新研究数据表明肺癌在全球癌症相关死亡率中高居首位［1］，其病理类型主要包括小细胞肺癌（small‑cell lung cancer， SCLC）和 非 小 细 胞 肺 癌（non‑small cell lung cancer，NSCLC），目前免疫治疗和靶向治疗的重大突破，显著提高了肺癌患者的预后［2］，延长了生存时间，但是免疫治疗和靶向治疗耐药性也屡见不鲜［3］。肺癌主要以NSCLC为主，并以其高转移性为主要特征，肺腺癌（Lung adenocarcinoma， LUAD）是非小细胞肺癌中最常见的病理类型［4］，其特点是LUAD 细胞的上皮‑间充 质 转 化（epithelial‑mesenchymal transition，EMT），且极易复发和转移［5］。有文献报道，靶向阻 断EMT 过 程 可 抑 制LUAD 细 胞 的 迁 移［6］，因此，抑制EMT 过程可能是干预LUAD 进展的一种潜在而有效的预防措施。
许多流行病学的研究结果表明，适当食用蔬菜和水果可以预防癌症并有效降低其发生率［7］，因此，从膳食植物来源的化学物质中寻找新的药物来干预肿瘤是可行的［8］。柠檬属于柑橘类水果，内含有多种多酚（主要是类黄酮），具有改善行为损伤、抗炎和预防癌症的作用［9，10］。圣草次苷（Eriocitrin）是从柠檬中提取的类黄酮，化学结构式见图，据报道Eriocitrin 能缓解DSS 诱导的小鼠的急性结肠炎［11］。此外，还有研究表明，Eriocitrin 可以改善饮食诱导肝癌细胞凋亡和抑制肝癌细胞增殖［12，13］。所以我们推测圣草次苷或许具有抗LUAD 细胞的作用，并可以抑制LUAD 细胞的增殖。在本实验中，我们首次证实了圣草次苷可能通过调控上皮间充质转化（Epithelial‑Mesenchymal Transition ，EMT）途径抑制LUAD 细胞的增殖和迁移，并促进铁死亡过程的发生。我们的结果提示圣草次苷可能是一种很有前途的肿瘤预防膳食添加剂，在LUAD 预防和药物治疗中具有一定的应用潜力。
1.1 细胞系来源
人LUAD 细胞系A549、H1299 均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
1.2 药物与试剂
圣草次苷购自上海融合医药科技发展有限公司；
RPMI‑1640 培养液、F‑12k 培养液、胎牛血清（fe‑tal bovine serum，FBS）、PBS 缓冲液购自武汉赛维尔生物科技有限公司；
CCK8 细胞活力检测试剂盒、BCA 蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物科技公司；
一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；
二抗、蛋白裂解液（RIPA）、总RNA 提取试剂盒（Trizol）、逆转录试剂盒和定量PCR 试剂（SYBR）均购自武汉塞维尔生物科技有限公司。
1.3 主要仪器
酶标仪、罗氏定量PCR 仪和ECL 化学发光显影仪来自武汉大学人民医院中心实验室。
1.4 细胞培养
LUAD 细胞系A549 和H1299 分别培养于含10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的F‑12k 培 养 液 和RPMI‑1640 培 养 液 中，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养。
1.5 CCK8 法检测圣草次苷对LUAD 细胞系A549、H1299 增殖能力的影响
将A549 和H1299 细胞接种于96 孔板内，每孔接种大约3 000 个。24 h 待细胞完全贴壁后弃上清，分别每孔加入含不同浓度圣草次苷（5、10、20、40、80、160 μmol/mL）的无血清培养基100 μL（同组设置3 个复孔），同时设置对照组不含圣草次苷的无血清培养基和空白调零孔。将96 孔板放入培养箱中继续培养24 和48 h 时后弃上清，每孔重新加入100 μL 培养基和10 μL CCK8 溶液，培养箱孵育2 h 后，测定450 nm 波长处的吸光度，分析并用GraphPad Prism 9 软件绘制细胞相对活性曲线。
1.6 划痕实验检测圣草次苷对LUAD 细胞系A549、H1299 的迁移能力的影响
将A549 和H1299 细胞经胰酶消化后接种于6孔板内，待细胞汇合度＆gt;90%时利用200 μL 移液枪头在培养箱板底垂直划线，用 PBS 缓冲液洗净未贴壁细胞后，分别加入含不同浓度圣草次苷（20、40、80 μmol/mL）的无血清培养基，同时设置对照组不含圣草次苷的无血清培养基；
继续培养0、24、48 h后显微镜观察拍照，每组每个时间点随机选4 个视野，取平均值作为每组每个时间点的最终结果，实验重复3 次。Image J 软件对图片进行分析处理。
1.7 Western Blot 法检测检测LUAD 细胞系A549、H1299 EMT 相关蛋白的表达水平
A549、H1299 细胞系常规培养后，给予40 μmol/mL 的圣草次苷作用48 h；
采用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，用BCA 试剂盒测定蛋白浓度并调整到相同浓度后，加热变性。每组取10 μL 样品进行电泳，转膜、封闭后，与4 ℃冰箱过夜孵育一抗E‑cadherin（货 号：20874‑1‑AP）、N‑cadherin（货 号：22018‑1‑AP）、Vimentin（货号：10366‑1‑AP）、GAP‑DH（货号：10494‑1‑AP）浓度均为1∶2 000；
次日洗膜后孵育二抗（G1213‑100UL）比例为1∶5 000，2 h后洗膜，ECL 化学发光成像系统显影，以GAPDH为内参，采用Image J 软件对蛋白条带进行半定量分析。实验重复3 次。
1.8 qRT‑PCR 法 检 测 检 测LUAD 细 胞 系A549、H1299 EMT 相 关 基 因mRNA 的 表 达
A549、H1299 细胞常规培养后，给予40 μmol/mL 的圣草次苷作用48 h；
用RNA 提取液提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA 后进行PCR扩增并定量测量浓度（引物序列见表1）。实验均重复3 次。
表1 本研究所使用的引物序列Tab1 The primer sequences used in this study
1.9 A549 和 H1299 细 胞ROS 水 平 测 定
DHE 在DMSO 中溶解至最终浓度为5 mmol/L，然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS， 1∶1 000）中进一步稀释至DMSO 的最终浓度为0.1%。A549、H1299 细胞系常规培养后，给予40 μmol/mL 的圣草次苷干预48 h；
将A549 和H1299 细 胞 接 种 于6 孔 板 中，用DCFH‑DA 工作液（10 μmol/L）在37 ℃下孵育30 min，最后用荧光显微镜观察ROS 水平，Image J 软件对图片进行分析处理。
1.10 Western Blot 法检测检测LUAD 细胞系A549、H1299 铁死亡相关蛋白的表达水平
A549、H1299 细胞系常规培养后，给予40 μmol/mL 的圣草次苷干预48 h；
采用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，用BCA 试剂盒测定蛋白浓度并调整到相同浓度后，加热变性。每组取10 μL 样品进行电泳，转膜、封闭后，与4 ℃冰箱过夜孵育一抗SLC7A11（26864‑1‑AP）、GPX4（货号：67763‑1‑Ig）、FTH（68068‑1‑Ig）抗体稀释比例均为1∶2 000；
次日洗膜后孵育二抗（G1213‑100UL）抗体稀释比例均为1∶5 000，2 h 后洗膜，ECL 化学发光成像系统显影。实验重复3 次。
1.11 统计学处理
2.1 圣草次苷对LUAD 细胞系A549、H1299 增殖能力的影响
不同浓度圣草次苷作用于LUAD 细胞系A549、H1299 后，可以明显抑制细胞的增殖。在圣草次苷干预细24、48 h 后，将空白组（0 μmol/mL）相对细胞活力设置为100%，则A549 细胞5、10、20、40、80、160 μmol/mL 组24 h 相对细胞活力有不同的抑制作用，结果见图1 和表2、3。与空白对照组相比，A549 和H1299 细胞在圣草次苷影响下，细胞增殖能力均受到了抑制，差异具有统计学意义，综上所述，圣草次苷可以抑制LUAD 细胞的增殖能力，且呈时间和浓度依赖性。
表2 不同浓度圣草次苷对肺腺癌A549 细胞增殖的影响（n=3，）Tab2 Effects of different concentrations of EriocitrinA on cell proliferation of lung adenocarcinoma A549 （n=3，）
表2 不同浓度圣草次苷对肺腺癌A549 细胞增殖的影响（n=3，）Tab2 Effects of different concentrations of EriocitrinA on cell proliferation of lung adenocarcinoma A549 （n=3，）
注：与空白对照组比较，**P＆lt;0.01，***P＆lt;0.001。
组别浓度(μmol/mL)空白对照组0 5 1 0圣草次苷组细胞活力（%）24 h 100 89.45±3.25**80.93±5.79***78.12±2.82***73.27±1.16***69.88±4.02***61.35±1.24***32.83＆lt;0.001 48 h 100 63.44±6.57***44.13±6.11***34.65±4.82***32.43±1.96***23.92±1.07***16.33±1.31***109.42＆lt;0.001 20 40 80 160 F P
图1 圣草次苷对LUAD 细胞A549、H1299 增殖能力的影响Fig1 Effect of Eriocitrin on proliferation of LUAD cells A549 and H1299
2.2 圣草次苷对LUAD 细胞系A549、H1299 迁移能力的影响
表3 不同浓度圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞增殖的影响（n=3， ）Tab3 Effects of different concentrations of EriocitrinA onthe proliferation of lung adenocarcinoma H1299 cells （n=3，）
表3 不同浓度圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞增殖的影响（n=3， ）Tab3 Effects of different concentrations of EriocitrinA onthe proliferation of lung adenocarcinoma H1299 cells （n=3，）
注：与 空 白 对 照 组 比 较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01，***P＆lt;0.001。
组别浓度(μmol/mL)48 h 100 64.24±5.62***48.02±3.44***42.47±2.86***29.83±4.44***22.78 ±3.23***18.16±2.72***149.54＆lt;0.001空白对照组0 5 1 0圣草次苷组20 40 80 160 F P细胞活力（%）24 h 100 90.82±6.47*82.83±6.02*77.76±1.48**71.71±1.97***69.44±3.82***67.55±4.86***20.26＆lt;0.001
表5 不同浓度圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞 迁移能力的影响（n=3， ）Tab5 Effects of different concentrations of Eriocitrin on mi⁃gration ability of lung adenocarcinoma H1299 cells（n=3，）
表5 不同浓度圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞 迁移能力的影响（n=3， ）Tab5 Effects of different concentrations of Eriocitrin on mi⁃gration ability of lung adenocarcinoma H1299 cells（n=3，）
注：与 空 白 对 照 组 比 较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01，***P＆lt;0.001。
组别空白对照组圣草次苷组浓度(μmol/mL)0 20 40 80 FP划痕愈合率（%）24 h 40.9±0.36**25.1±2.46***17.7±0.50***10.1±0.54***580.35 48 h 52.5±1.03***29.2±0.87***18.7±0.88***9.39±2.47***724.13＆lt;0.001＆lt;0.001
划痕实验结果表明，与对照组比较，不同浓度圣草次苷（20、40、80 μmol/mL）作用于LUAD 细胞A549 和H1299 后，结 果 见 图2 和 表4‑5，实 验 组LUAD 的细胞迁移能力受到显著抑制，差异具有统计学意义，且呈时间和浓度依赖性。
表4 不同浓度圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞 迁移能力的影响（n=3，）Tab4 Effects of different concentrations of Eriocitrin on mi⁃gration ability of lung adenocarcinoma A549 cells （n=3，）
表4 不同浓度圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞 迁移能力的影响（n=3，）Tab4 Effects of different concentrations of Eriocitrin on mi⁃gration ability of lung adenocarcinoma A549 cells （n=3，）
注：与 空 白 对 照 组 比 较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01，***P＆lt;0.001。
组别空白对照组圣草次苷组浓度(μmol/mL)0 20 40 80 FP划痕愈合率（%）24 h 34.92±3.97 27.13±1.45*18.25±0.65**8.83±0.51***110.12 48 h 53.44±3.26 33.47±1.33***19.51±0.33***9.91±0.99***417.94＆lt;0.001＆lt;0.001
图2 圣草次苷对LUAD 细胞A549、H1299 迁移能力的影响Fig2 Effects of Eriocitrin on migration ability of LUAD cells A549 and H1299
2.3 圣草次苷对LUAD 细胞系A549、H1299 EMT的影响
如 图3 所 示，Western blot 实 验 和 mRNA 的 结果显示：圣草次苷（40 μmol/mL）作用48 h 后，能够显 著 增 加A549、H1299 细 胞 中 的N‑cadherin、Vi‑mentin 及E‑的蛋白表达水平（图3）。圣草次苷（40 μmol/mL）作 用48 h 后A549、H1299 细 胞 系 中 的N‑cadherin和SnailmRNA 表 达 下 调，同 时E‑cadherin 的mRNA 表达上调，差异具有统计学意义（表6～9）。
表6 圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Vimentin 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab6 Effects of Eriocitrin on expression of E⁃cadherin，N⁃cadherin and Vimentin in lung adenocarcinoma A549 cells （n=3，
表6 圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Vimentin 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab6 Effects of Eriocitrin on expression of E⁃cadherin，N⁃cadherin and Vimentin in lung adenocarcinoma A549 cells （n=3，
注：与空白对照组比较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01。
组别空白对照组圣草次苷组浓度（μmol/mL）0 40 EMT 相关蛋白E‑cadherin 1.01±0.07 1.48±0.08**7.45 0.002 Vimentin 1.05±1.19 0.57±0.08*3.88 0.018 t P N‑cadherin 1.00±0.47 0.49±0.09**7.45 0.001
图3 圣草次苷对LUAD 细胞A549、H1299 EMT 相关蛋白及基因水平的影响Fig3 Effects of Eriocitrin on EMT‑related proteins and genes of A549 and H1299 in LUAD cells
表7 圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Vimentin 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab7 Effects of Eriocitrin on expression of E⁃cadherin，N⁃cadherin and Vimentin in lung adenocarcinoma H1299 cells （n=3，
表7 圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Vimentin 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab7 Effects of Eriocitrin on expression of E⁃cadherin，N⁃cadherin and Vimentin in lung adenocarcinoma H1299 cells （n=3，
注：与空白对照组比较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01。
组别EMT 相关蛋白E‑cadherin 0.99±0.07 1.74±0.23**5.42 0.006浓度(μmol/mL)0 40空白对照组圣草次苷组Vimentin 1.00±0.04 0.66±0.12*3.23 0.032 t P N‑cadherin 1.00±0.09 0.54±0.09**5.42 0.004
2.4 圣草次苷对LUAD 细胞系A549、H1299 铁死亡的影响
如 图4 所 示，Western blot 实 验 和ROS 的 检 测结果显示：圣草次苷（40 μmol/mL）作用48 h 后，能够显著增加A549、H1299 细胞系中ROS 水平（图4A，B），降低了铁死亡相关蛋白SLC7A11，FTH 的蛋白表达水平，差异具有统计学意义（图4C～F，表10～11）。
表8 圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Snail mRNA 表达的影（n=3，）Tab8 Effect of Eriocitrin on E⁃cadherin， N⁃cadherin and Snail mRNA expression in lung adenocarcinoma A549 cells（n=3，
表8 圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Snail mRNA 表达的影（n=3，）Tab8 Effect of Eriocitrin on E⁃cadherin， N⁃cadherin and Snail mRNA expression in lung adenocarcinoma A549 cells（n=3，
注：与空白对照组比较，*P＆lt;0.05，***P＆lt;0.001。
组别EMT 相关mRNA空白对照组圣草次苷组浓度（μmol/mL）0 40 Snail 1.00±0.08 0.38±0.04***12.27＆lt;0.001 t P E‑cadherin 0.95±0.10 1.72±0.11***9.18＆lt;0.001 N‑cadherin 1.03±0.15 0.72±0.11*2.82 0.048
表9 圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Snail mRNA 表达的影响（n=3， Tab9 Effects of Eriocitrin on the expression of E⁃cadherin，N⁃Cadherin and Snail mRNA in lung adenocarcinoma H1299 cells（n=3，
表9 圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞中 E⁃cadherin、N⁃cadherin 和 Snail mRNA 表达的影响（n=3， Tab9 Effects of Eriocitrin on the expression of E⁃cadherin，N⁃Cadherin and Snail mRNA in lung adenocarcinoma H1299 cells（n=3，
注：与空白对照组比较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01。
EMT 相关mRNA组别空白对照组圣草次苷组浓度(μmol/mL)0 40 E‑cadherin 1.04±0.35 2.20±0.16**N‑cadherin 1.21±0.32 0.38±0.08*Snail 1.05±0.35 0.41±0.05*3.04 0.038 t P 5.28 0.006 3.37 0.028
图4 圣草次苷对LUAD 细胞A549、H1299 ROS 和铁死亡的影响Fig4 Effect of Eriocitrin on the death of A549， H1299 ROS and Ferroptosisin LUAD cells
表10 圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞中 SLC7A11、FTH 和GPX4 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab10 Effects of Eriocitrin on the expression of SLC7A11，FTH and GPX4 proteins in lung adenocarcinoma A549 cells（n=3，）
表10 圣草次苷对肺腺癌 A549 细胞中 SLC7A11、FTH 和GPX4 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab10 Effects of Eriocitrin on the expression of SLC7A11，FTH and GPX4 proteins in lung adenocarcinoma A549 cells（n=3，）
注：与 空 白 对 照 组 比 较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01，***P＆lt;0.001。
组别浓度(μmol/mL)0 40铁死亡相关蛋白SLC7A11 1.00±0.08 0.75±0.06*4.46 0.011 GPX4 1.00±0.09 0.30±0.03***13.35＆lt;0.001空白对照组圣草次苷组t P FTH 1.03±0.17 0.35±0.07**6.25 0.003
表11 圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞中 SLC7A11、FTH 和GPX4 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab11 Effects of Eriocitrin on the expression of SLC7A11，FTH and GPX4 proteins in lung adenocarcinoma H1299 cells Sound（n=3， ）
表11 圣草次苷对肺腺癌 H1299 细胞中 SLC7A11、FTH 和GPX4 蛋白表达的影响（n=3， ）Tab11 Effects of Eriocitrin on the expression of SLC7A11，FTH and GPX4 proteins in lung adenocarcinoma H1299 cells Sound（n=3， ）
注：与空白对照组比较，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01。
组别铁死亡相关蛋白SLC7A11 1.00±0.02 0.71±0.07**7.05 0.002浓度(μmol/mL)0 40空白对照组圣草次苷组GPX4 1.00±0.05 0.64±0.15*4.11 0.015 t P FTH 1.04±0.08 0.59±0.05**8.16 0.001
肺癌仍然是全球癌症相关死亡的重要原因，其中主要是LUAD［4］。尽管手术切除治疗、免疫治疗、靶向治疗、化疗和放疗等癌症治疗手段层出不穷，但由于LUAD 患者的转移和复发率仍较高，其预后不尽人意。因此，探索新的、有效的化疗药物是很有必要的。圣草次苷作为一种天然的类黄酮，已被证明在体外和体内具有多种有益作用。本研究发现圣草次苷可能通过EMT 途径抑制LUAD 细胞增殖和细胞迁移能力，研究显示因肿瘤转移而导致死亡人数占癌症患者总体死亡人数的90%以上［14］，所以EMT 是肿瘤转移和治疗耐药的关键过程。
本研究中，采用CCK8 法检测圣草次苷对A549和H1299 细胞系增殖能力的抑制作用，结果显示圣草次苷以浓度依赖性的方式显著抑制肿瘤细胞的增殖能力，这一结果与之前的研究结果一致，曾有研究报导膳食黄酮类化合物具有较强的抗癌和抗增殖特性，能降低患癌风险［15］。此外，圣草次苷被证明可通过多种机制触发细胞凋亡，从而抑制乳腺癌细胞和肝癌细胞的增殖［12，13］。此外，本研究结果显示圣草次苷还可以抑制肿瘤细胞的迁移，促进A549 和H1299 细胞系中EMT 标志物（E‑cadherin）的蛋白表达增加，降低了EMT 标志物（N‑cadherin和vimentin）的蛋白表达水平。此外，研究显示snail作为转录调控因子可以抑制E‑cadherin 的表达，并在促进癌症EMT 过程中发挥关键作用［16］，而本研究发现圣草次苷作用下，这一过程会受到抑制。本研究首次揭示了圣草次苷在可能通过EMT 途径抑制增殖和转移，同时还发现一定浓度的圣草次苷抑制LUAD 细胞的增殖并促进铁死亡的发生。
当然，本研究有局限性。首先，虽然发现Snail的表达在mRNA 水平上被抑制，但没有检测其他可能介导EMT 的转录因子水平；
其次，目前的研究均在体外进行，缺乏动物实验及临床实验验证此结果的有效性，这也将是本课题组下一步研究的方向。综上所述，圣草次苷可能通过EMT 途径抑制LUAD 细胞增殖和迁移，本研究提示圣草次苷在肺腺癌的预防和辅助化疗中具有一定的应用潜力。
作者贡献度说明：
高明朗、赖凯：主要实验执行、数据分析和论文撰写；
邓宇、卢子龙：协助实验执行；
徐宸桢、王文捷：数据整理及分析；
耿庆、李宁：实验设计指导与论文修改。
所有作者声明不存在利益冲突关系。
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