赵梓童，年四辉，孙绪强，汪 伟，张 青，彭代银，周凌云，2
（1.皖南医学院 药学院， 安徽 芜湖241002；
2.皖南中草药活性成分筛选与再评价省工程实验室， 安徽 芜湖 241002；
3.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；
4.安徽道地中药质量提升协同创新中心，安徽 合肥 230012；
5.安徽省中药方剂重点实验室，安徽 合肥 230012）
高尿酸血症是一种高度流行的由嘌呤代谢障碍所致的慢性代谢性疾病，主要与血清尿酸水平过高有关，尿酸盐水平过饱和导致尿酸单钠盐结晶的形成，是痛风发病的核心［1］。近年来，由于生活水平的提高及饮食结构的改变，高尿酸血症影响着人们的健康和生活质量，高尿酸血症也是慢性肾脏病、心血管疾病、糖尿病、及脑卒中的独立危险因素［2‑5］。
降低血清尿酸水平是高尿酸血症防治的首要方法［6］，但目前临床应用的降尿酸西药别嘌呤醇、苯溴马隆、拉布立酶等虽然疗效较好，但都存在一定的肝肾损害、过敏反应等毒副作用［7，8］。相对而言，许多降尿酸中草药在长期使用过程中存在疗效显著、安全性高、毒副作用低等特点，具有发展成为目前临床药物替代品的潜力［9，10］。
茯苓为常用的药食同源植物［11］，表明它的使用是比较安全的。茯苓根据入药部位的不同，可分为茯苓和茯苓皮［12］，它们所包含的三萜类成分和多糖具有广泛的药理活性，如利尿、抗炎、抗氧化［13，14］等多种生物活性，其中利尿作用是最为主要的临床应用。茯苓皮与茯苓相比，茯苓皮更擅长利水消肿［15］。进一步调查研究发现很多公认的中药利尿剂比如泽泻［16］、树舌灵芝［17］、车前草［18］、茯苓均可降低血清尿酸，值得注意的是，三萜类成分是茯苓、泽泻及茯苓皮的主要有效成分，树舌灵芝和车前草也包含部分三萜，而三萜类化合物在结构上与醛固酮相似，可以竞争相应的受体来发挥利尿作用［19］。而且茯苓皮中的三萜类物质含量远高于茯苓［20］，茯苓皮总三萜含量为2.45%～4.53% ，茯苓皮中总三萜含量是茯苓的3.15～8.06 倍［21］。此外，茯苓还是五苓散中所包括的主要利尿中药，而五苓散作为一个常用利尿消水肿的中药复方，现代临床也被用于痛风性关节炎的治疗［22，23］。目前，从中药中筛选活性成分已成为发现新药的一条途径，然而，关于茯苓皮是否可降低血清尿酸还尚未有文献报道。因此，本文旨在研究茯苓皮醇提物和水提物对次黄嘌呤和氧嗪酸钾引起的高尿酸小鼠的降尿酸效应和改善肾损伤的情况。
1.1 材料和仪器
1.1.1 材料 茯苓皮购自安徽亳州中药材市场，经皖南医学院中药研究所鉴定为多孔菌科真菌茯苓菌核的外皮。茯苓皮醇提取物及水提物由皖南医学院中药研究所制备。
1.1.2 仪器 多功能提取浓缩机（YC‑050；
上海领航仪器设备有限公司，中国上海）；
高速冷冻离心机（JW‑3021HR；
安徽嘉文仪器设备有限公司）；
多功能酶标仪（1510；
赛默飞世尔科技公司）；
紫外分光光度计（UV‑5100；
日本株式会社日立高新技术科学）；
石蜡包埋机（EG1150H；
徕卡显微系统有限公司）；
石蜡切片机（RM2245；
徕卡生物系统有限公司）；
十万分之一天平（AUW220D；
日本岛津公司）；
超高效液相色谱仪（1290 infinity Ⅱ；
美国安捷伦公司）
1.1.3 药品与试剂 次黄嘌呤和氧嗪酸钾购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
苯溴马隆购由常州康普药业有限公司提供；
羧甲基纤维素钠（CMC‑Na）购自北京索莱宝科技有限公司；
土莫酸（纯度＆gt;98%）购于成都普思生物科技股份有限公司；
尿酸、肌酐、尿素氮、试剂盒购自江苏南京建成生物技术研究所；
小鼠阴离子转运蛋白 1（OAT1）、尿酸转运体 1（URAT1）、葡萄糖转运蛋白 9（GLUT9）Elisa试剂盒购自苏州卡尔文科技有限公司；
小鼠肿瘤坏死因子α（TNF‑α）和白介素6（IL‑6）Elisa 试剂盒购自武汉爱博泰克生物技术公司。
1.1.4 动物 SPF 级雄性昆明小鼠（20～24 g），6～8 周龄，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，
生产许可证编号：SCXK 2020‑0005，动物被安置在（20±2）℃温度下，光照12 h/d，并自由获取食物和水一周以适应实验环境。在本研究中，动物处理完全遵守国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》和卫生部发布的《医学实验动物管理实施细则》，且均按照皖南医学院伦理委员会的指导方针进行，并经皖南医学院研究伦理委员会批准，道德伦理编号：LLSC‑2021‑164。
1.2 方法
1.2.1 药物的制备 取茯苓皮药材2 900 g，加12 倍量95%乙醇，65℃并加压条件下提取两次，每次两小时，合并两次滤液浓缩冻干，得PCE，以土莫酸为对照品（纯度＆gt;98%），高效液相色谱法测定含量为20.14%：精密称取土莫酸2.00 mg，置于5 mL 的容量瓶中，加入甲醇至刻度，超声摇匀，依次稀释成每毫升含土莫酸0.4、0.32、0.26、0.21、0.17 mg 的对照品溶液，于0.22 μm 微孔滤膜过滤；
精密称取冻干的茯苓皮醇提物粉末0.10 g，置于10 mL 的容量瓶中，加入甲醇定容，超声溶解，微孔滤膜0.22 μm 过滤，得10 mg/mL 的供试品溶液；
使用Agilent ZORB‑AX Eclise Plus C18column （2.1 mm × 100 mm，1.8 μm） 色谱柱，Agilent UPLC guard 3PK （2.1 mm ×5 mm，1.8 μm） 预柱，以0.1%甲酸水和乙腈溶液为流动相，水相与有机相的比例见表1，流速0.3 mL/min，进样量3 μL，柱温30 ℃，检测波长210 nm；
以土莫酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得标准曲线方 程 为y=8054.1x+28.396（R2=0.9991），将 茯 苓皮醇提物峰面积代入后并计算其含量，重复三次含量平均值为20.14%。
表1 梯度洗脱程序Tab1 Gradient elution program
醇提后的茯苓皮烘干后称重2 500 g，加10 倍量水，其他条件同醇提物的制备，得PCW，采用苯酚‑硫酸比色法测得茯苓皮水提物多糖含量为30.40%：精密称定葡萄糖对照品1.04 mg，加超纯水溶解并定容至10 mL，混匀，即得0.10 mg/mL 的标准葡萄糖溶液；
精密称取茯苓皮水提物冻干粉末1.50 mg，置于10 mL 容量瓶中并用超纯水定容，混匀即得0.15 mg/mL 的供试品溶液；
稀释对照品溶液使其浓度分别为100、80、60、40、20、10 μg/mL，各取200 μL加入试管中，然后在每只试管中加入5%苯酚溶液200 μL，涡旋后加入浓硫酸1 mL，混匀，冷却至室温，测定490 nm 波长下的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，OD490 nm 值为纵坐标，得标准曲线方程为y = 0.0151x + 0.0736（R2= 0.9990），将茯苓皮水提物平均OD 值代入后并计算其含量为30.4%。
1.2.2 分组、造模与给药 将70 只雄性昆明小鼠随机分为7 组：空白组、模型组、PCE 高剂量（PCEH，388 mg/kg）、PCE 低剂量PCE（PCEL，97 mg/kg）、PCW 高剂量PCW（PCWH，96 mg/kg）、PCW 低剂量（PCWL， 24 mg/kg）、BEN（7.5 mg/kg）。空白组小鼠灌胃生理盐水。根据文献和预实验，连续使用诱导剂次黄嘌呤500 mg/kg 和氧酸钾250 mg/kg 对雄性昆明小鼠构建HUA 模型［24］。诱导剂与治疗的时间间隔控制在1 h［25］，造模后空白组小鼠灌胃生理盐水，其余组给予相应药物，给药前药物恢复至室温并摇匀，整个过程持续16 d，实验过程中观察并记录小鼠状态。
1.2.3 指标检测 各组小鼠末次给药用代谢笼收集24 h 尿液，期间禁食不禁水。收集的尿液记录尿量（UV）后于2 000 r、10 min 条件下离心取上清用于UUA、UCr 的测定。然后所有小鼠用棉球蘸适量乙醚置于鼻侧麻醉，取小鼠眼球采血，并将其断颈处死，分离左右肾，所有血样置于4℃环境下2 h 后，离心（3 500 r， 15 min）采 集 血 清 用 于SUA、SCr 和BUN 的测定；
计算FEUA 和CUr（FEUA =（UUA× SCr）/（SUA × UCr）× 100，CUr =（UV ×UUA）/（SUA × 1 440）× 100）。左肾用于记录形态学和匀浆的制备，匀浆上清用于阴离子转运蛋白1（OAT1）、尿酸转运体1（URAT1）、葡萄糖转运蛋白9（GLUT9）、肿瘤坏死因子α（TNF‑α）和白介素6（IL‑6）的测定，右肾置于4%多聚甲醛中固定一周后用HE 染色法观察病理变化。所有尿液、肾脏和血清样品均储存在～80℃以供进一步的指标分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS Statistic 20.0 软件进行分析，结果用平均值标准偏差表示。对照组与模型组的统计学比较采用独立样本t检验。通过方差分析（ANOVA） 对各实验组和模型组进行分析。方差一致时采用LSD 检验，方差不齐时采用Dunnett 检验。P＆lt;0.05 被认为具有统计学意义。
2.1 PCE 和PCW 对HUA 小鼠SUA、SCr、BUN、UV、UUA、UCr、FEUA 和CUr 的影响
除UV 外，各指标与空白组相比，均有统计学意义（P＆lt;0.01）。有关尿酸排泄相关的指标SUA、UUA、FEUA 和CUr，仅两高剂量组及阳性药与模型组有统计学差异（P＆lt;0.01）；
有关肾脏损伤相关的指标SCr、BUN 和UCr，各给药组与模型组相比均有统计学意义（P＆lt;0.05），不同的是各高剂量组效果比低剂量更显著。见表2。
表2 各组HUA 小鼠SUA、SCr、BUN、UV、UUA、UCr、FEUA 和CUr 结果（n=10，）Tab2 The result of SUA， SCr， BUN， UV， UUA， UCr， FEUA and CUr in HUA mice（n=10）
表2 各组HUA 小鼠SUA、SCr、BUN、UV、UUA、UCr、FEUA 和CUr 结果（n=10，）Tab2 The result of SUA， SCr， BUN， UV， UUA， UCr， FEUA and CUr in HUA mice（n=10）
注：与空白组相比，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01 ；
与模型组比较，#P＆lt;0.05, ##P＆lt;0.01。
CUr（%）1.17 ± 0.20 0.47 ± 0.05**1.17 ± 0.18##0.58 ± 0.07 1.17 ± 0.09##0.52 ± 0.11 1.22 ± 0.29##组别空白组模型组PCEH PCEL PCWH PCWL阳性药组（BEN）SUA（mg/L）28.03 ± 3.02 51.58 ± 3.06**32.99 ± 2.91##47.13 ± 4.71 32.35 ± 1.95##47.57 ± 6.15 27.00 ± 4.66##SCr（μmol/L）15.19 ± 2.34 23.38 ± 1.11**19.83 ± 2.37##20.57 ± 2.13#16.52 ± 1.76##20.74 ± 1.59#28.22 ± 2.01##BUN（mmol/L）5.65 ± 1.02 15.24 ± 1.45**8.55 ± 0.93##14.41 ± 1.09#9.99 ± 0.48##14.92 ± 1.69#11.61 ± 1.68##UV（mL）1.64 ± 0.18 1.96 ± 0.13 2.48 ± 0.19##2.10 ± 0.15 2.45 ± 0.04##2.08 ± 0.16 2.10 ± 0.08 UUA（mg/dL）28.56 ± 3.08 17.68 ± 1.58**22.20 ± 1.91##18.45 ± 0.93 22.12 ± 0.97##16.73 ± 0.45 21.82 ± 2.61##UCr（mmol/L）1.31 ± 0.07 1.07 ± 0.04**1.24 ± 0.05##1.16 ± 0.04#1.26 ± 0.03##1.16 ± 0.03#0.91 ± 0.06##FEUA（%）11.78± 0.99 7.48 ± 0.46**10.74± 0.86##7.02 ± 1.39 8.96 ± 0.40##6.37 ± 0.91 25.68± 5.74##
2.2 PCE 和PCW 对HUA 小 鼠 肾 组 织OAT1，URAT1，GLUT9，TNF‑α 和IL‑6 水平的影响
各指标与空白组相比，均具有统计学差异意义（P＆lt;0.05）。有关促进尿酸排泄和重吸收的指标OAT1，URAT1 和GLUT9，醇提取物和水提取物的高剂量以及阳性药与模型组相比有明显疗效（P＆lt;0.05）；
和肾脏炎症有关的两炎症因子指标，醇提取物和水提取物的高低剂量与模型组相比含量均明显降低（P＆lt;0.05），其中低剂量效果次于高剂量。见表3。
表3 各组小鼠OAT1，URAT1，GLUT9，TNF⁃α 和IL⁃6 结果（n=10）Tab3 The result of OAT1，URAT1，GLUT9，TNF⁃α and IL⁃6 in HUA mice（n=10，）
表3 各组小鼠OAT1，URAT1，GLUT9，TNF⁃α 和IL⁃6 结果（n=10）Tab3 The result of OAT1，URAT1，GLUT9，TNF⁃α and IL⁃6 in HUA mice（n=10，）
注：与空白组相比，*P＆lt;0.05，**P＆lt;0.01；
与模型组比较，#P＆lt;0.05, ##P＆lt;0.01。
IL‑6（pg/mL）190.28 ± 15.46 742.78 ± 62.09**554.44 ± 34.87##662.69 ± 42.40#533.89 ± 29.77##679.44 ± 33.60#766.94 ± 29.42组别空白组模型组PCEH PCEL PCWH PCWL阳性药组（BEN）OAT1（ng/mL）55.10 ± 2.22 48.57 ± 2.37**54.74 ± 3.24##48.50 ± 3.31 55.15 ± 4.08##49.16 ± 5.05 55.17 ± 3.70##URAT1（ng/mL）55.02 ± 3.12 68.89 ± 3.33**59.54 ± 2.73##64.32 ± 5.09 62.15 ± 3.14##64.10 ± 5.86 54.21 ± 4.29##GLUT9（ng/mL）63.94 ± 3.76 72.25 ± 5.22**63.80 ± 2.87##69.26 ± 4.42 64.70 ± 4.15##69 ± 3.05 61.17 ± 2.11##TNF‑α（pg/mL）165.06 ± 7.50 670.58 ± 79.49**429.87 ± 34.04##516.99 ± 24.89#425.32 ± 32.15##517.18 ± 28.03#651.41 ± 55.18
2.3 PCE 和PCW 对HUA 小鼠肾组织形态和病理变化的影响
如图1 所示，模型组（B）小鼠在次黄嘌呤和氧酸钾诱导后与空白组（A）相比表现出明显的肾脏疾病，模型组小鼠的肾脏表面颜色较浅，同时，BEN 组肾脏表面颜色较模型组又浅一些，甚至出现肾脏肿大。相反，PCE（C 和D）组和PCW（E 和F）组小鼠肾脏疾病明显减少，且其形态更倾向于空白组。因此，对肾组织进行了HE 染色，以进一步了解肾组织的病理结果。将肾脏处理成5 μm 切片，然后进行HE 染色。空白组小鼠和其它实验组小鼠之间的肾脏组织病理学变化如图2 所示。空白组小鼠肾切片显示正常肾结构，模型组肾切片显示肾小球体积增大，肾小管局部扩张空泡化，肾小管上皮细胞重度脱落。与模型组相比，PCE 组和PCW 组小鼠肾脏的肾小球体积较小，肾囊与肾小管之间的间隙更接近空白组，肾囊边缘也更清晰，肾小管空泡化症状减轻，且整体比苯溴马隆组损伤较小。
图1 PCE 和PCW 对HUA 小鼠肾组织形态变化的影响Fig1 Effects of PCE and PCW on the morphological of kidney tissue in HUA mice
图2 PCE 和PCW 对HUA 小鼠肾组织病理变化的影响 （蓝色箭头：肾小球，绿色箭头：肾小管，红色箭头：肾囊与肾小管之间的间隙）（HE×400）Fig2 Effects of PCE and PCW on the pathological changes of kidney tissue in HUA mice.Blue arrow， glomeruli.Green arrow， renal tubule.Red arrow， the space between the renal tubules and the renal sacs （HE×400）
在本研究用次黄嘌呤和氧嗪酸钾诱导高尿酸血症模型，考察了茯苓皮醇提物和水提物对HUA小鼠体内尿酸的影响，结果显示茯苓皮提取物可降低HUA 小鼠的尿酸水平。此外，次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合造模具有肾脏毒性，茯苓皮提取物可显著改善肾损伤减轻肾脏炎症。
尿酸是体内嘌呤代谢的最终产物［26］。SUA 水平 通常和肾尿酸排泄相关［27］。
从SUA 和UUA 来看，模型组小鼠SUA 较空白组升高（P＆lt;0.01），UUA 降低（P＆lt;0.01），说明本次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合造模成功，醇提物和水提物的高剂量组的小鼠血清尿酸水平相比模型组均能降低尿酸水平，但两提取物的低剂量无效，表明可能跟剂量有关。SCr、BUN 水平升高表明肾功能不全，导致肾功能受损［28‑30］。此外，HUA 患者的肌酐与尿酸合成之间存在密切的相关性［31］。各提取物高低剂量可剂量依赖降低SCr 和BUN，为更准确的评价肾损伤，对HUA 小鼠的肾脏进行了形态学和病理情况观察，各提取物高低剂量组可不同程度的改善肾脏损伤，且肾损伤远远小于BEN。显示出中药副作用小的优点。现在临床上所应用的降尿酸药物毒副作用很大，所以从中药中筛选不良反应较小的有效部位或单体会成为今后的研究热点。
FEUA 和CUr 是反映肾脏尿酸排泄比例的敏感指标［32］。正常情况下，SUA 水平与UUA 呈负相关，受年龄、性别、饮食习惯、气候等因素影响，但FEUA 是指尿酸经肾小球滤过后随尿液排出的百分比，可排除其他混杂因素的影响［33］。因此，其可以更好地反映肾小管处理尿酸的能力，准确评价尿酸的排泄。一些研究认为，FEUA 与肾小管的结构或功能有关［34］。更重要的是，SUA 的水平与FEUA和CUr 的相关性最好［31］。因此，通过测量FEUA 和CUr 的水平，更准确地评估小鼠的肾脏尿酸排泄。与空白组相比，模型组的FEUA 和CUr 均降低，提示模型组小鼠肾功能损害或构建此模型的方法可抑制小鼠的尿酸排泄。与模型组相比，PCEH、PC‑WH 和BEN 均能有效促进尿酸的排泄和清除。
肾脏是尿酸排泄最重要的器官［35］。促进尿酸排泄的药物的主要作用靶点是尿酸转运蛋白。OAT1 是一种新型肾脏转运蛋白，参与促进尿酸的排 出［36］。URAT1 和GLUT9 可 将 肾 小 管 管 腔 内 的尿酸再吸收到细胞内，完成尿酸的重吸收［37］。此外，炎症反应是HUA 的典型病理特征。据报道过量尿酸可促进肾脏中促炎因子（TNF‑α、IL‑6）的分泌，导致肾脏炎症［38］。炎症因子的减少有助于减少肾脏的炎症，可以更好地保护肾脏［39］，尿酸转运蛋白表达结果显示，PCEH 和PCWH 可通过调节尿酸转运蛋白减少尿酸重吸收，促进尿酸排泄。肾组织TNF‑α 和IL‑6 浓度水平结果显示，PCE 和PCW 能较好地减轻HUA 小鼠肾脏炎症，且两高剂量组小鼠肾炎症程度低于两低剂量组。
综上所述，本研究首次考察了茯苓皮的醇提取物和水提取物对次黄嘌呤和氧嗪酸钾所致高尿酸血症小鼠的影响，结果表明该提取物能有效的降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，上述作用可能是通过促进尿酸排泄、抑制尿酸转运体URAT1 和葡萄糖转运蛋白GLUT9 的表达，促进尿酸转运蛋白OAT1 表达有关。茯苓皮提取物亦可保护高尿酸小鼠肾脏功能及肾脏炎症状态，可能与降低肾脏中炎症因子的表达有关。本研究仅仅只是茯苓皮醇提取物和水提取物对高尿酸血症小鼠药效作用的初步探究，其药效机制还与免疫、代谢等因素有关，因此课题组后续会进一步筛选茯苓皮的活性部位或单体成分并增加体外实验以寻找更多的信号通路促进该领域的发展，为今后茯苓皮作为治疗此疾病的新药开发奠定基础。
所有作者声明不存在利益冲突关系。
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