陈晓娟 曹 鑫 薛理丹 宋 愈
糖尿病性白内障是糖尿病患者较早发生的眼部并发症，也是致盲的主要原因之一[1]。与年龄相关性白内障(ARC)相比，糖尿病性白内障发病更早、进展更快[2]。长期慢性的高糖刺激能够改变晶状体渗透压，引起活性氧异常积聚，诱发晶状体氧化应激反应，继而导致晶状体上皮细胞(LEC)发生凋亡和自噬等一系列变化，最终形成白内障[3-4]。持续的高血糖会造成机体内分泌和代谢紊乱，致使糖尿病性白内障患者术后并发症的发生率要高于ARC患者[5]。因此，基于糖尿病性白内障发病机制寻找能够从源头预防其发生或延缓其进展的分子靶点迫在眉睫。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种含有HMG-box结构域的DNA结合蛋白，在免疫、炎症、凋亡和自噬等过程中发挥重要作用[6]。近年来，越来越多的研究表明HMGB1在糖尿病及其并发症的致病过程中扮演着至关重要的角色[7-9]。然而，有关HMGB1在糖尿病性白内障进展过程中的具体调控机制报道较少。本研究拟检测HMGB1在糖尿病性白内障患者和ARC患者晶状体前囊膜以及高糖和正常糖条件下培养的人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)中的表达情况，分析HMGB1的表达变化对高糖诱导的LEC凋亡及自噬的影响，以期为糖尿病性白内障的发病机制研究和防治措施开发提供潜在靶点。
1.1 材料
1.1.1 晶状体前囊膜标本来源选取2021年10月至2022年3月在南通大学第二附属医院眼科确诊为白内障的患者20例，依据白内障类型分为糖尿病性白内障组(DC组)和ARC组，每组各10例，取患者晶状体前囊膜进行实验。两组患者的年龄(P=0.70)和性别构成(P=0.66)，差异均无统计学意义。患者入组标准：(1)DC组：经眼科诊断为白内障，经内分泌科诊断为2型糖尿病；
年龄为50～80岁；
排除其他诱因导致的白内障，如外伤性、药物性白内障等；
排除高度近视、葡萄膜炎、青光眼等具有其他眼病史及眼科手术史；
排除具有心血管疾病、甲状腺功能亢进等对全身代谢影响较大的疾病。(2)ARC组：无糖尿病病史，其他入组标准同DC组。本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，在实验开始前已对所有参与者阐明本研究目的和方法，并签署书面的知情同意书。
1.1.2 实验细胞来源和试剂人晶状体上皮细胞株(SRA01/04)(日本理化学研究所)，正常糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、青链霉素(美国Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(阿根廷Natocor公司)，HMGB1抗体(11000)、Bax抗体(11000)、Bcl-2抗体(11000)、LC3B抗体(11000)、p62抗体(11000)(英国Abcam公司)，Trizol试剂、Lipofectamine 3000(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司)，引物、siRNA(中国锐博生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 晶状体前囊膜标本收集所有患者均由同一手术医师行超声乳化白内障吸除术+人工晶状体植入术，通过环形撕囊，收集晶状体中央前囊膜(含LEC)。置于-80 ℃冰箱保存。
1.2.2 细胞培养与高糖处理将SRA01/04细胞培养于含青链霉素和体积分数10%FBS的完全培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱中。选用第3代细胞进行实验。将细胞分为正常糖组和高糖组，正常糖组培养基含5.5 mmol·L-1葡萄糖，高糖组培养基含25.0 mmol·L-1葡萄糖，处理24 h后进行后续实验。
1.2.3 晶状体前囊膜标本及SRA01/04细胞蛋白提取晶状体前囊膜蛋白提取：从-80 ℃冰箱中取出前囊膜组织，按前囊膜质量与蛋白裂解液体积1 mg10 μL的比例，加入相应体积蛋白裂解液，于4 ℃摇床裂解1 h，离心后收集上清。细胞蛋白提取：将细胞置于冰上，加入适量蛋白裂解液，冰上裂解10 min后将细胞刮下转移至1.5 mL EP管中，4 ℃裂解1 h，离心后收集上清。
1.2.4 细胞转染与分组将细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁固定后将细胞随机分为正常对照组、scr-siRNA组和si-HMGB1组。正常对照组：不作任何处理；
scr-siRNA组：加入等量的Lipofectamine 3000和scr-siRNA；
si-HMGB1组：加入等量的Lipofectamine 3000和si-HMGB1。三组细胞均用含5.5 mmol·L-1葡萄糖的培养基培养48 h，随后提取RNA用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测。将细胞随机分为正常糖组、高糖组、高糖+scr-siRNA组、高糖+si-HMGB1组。高糖+scr-siRNA组、高糖+si-HMGB1组细胞按上述方式进行转染，待收集细胞前24 h，正常糖组细胞用含5.5 mmol·L-1葡萄糖培养基培养，高糖组、高糖+scr-siRNA组、高糖+si-HMGB1组细胞用含25.0 mmol·L-1葡萄糖的培养基培养。HMGB1 siRNA序列：正向为5’-GGCUUUCACUUAAGAACUUTF-3’，反向为5’-AAGUUCUUAAGUGAAAGCCTF-3’；
非特异性siRNA(scr-siRNA)序列：正向为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATY-3’。
1.2.5 Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达每孔加入20 μg上述蛋白，采用SDS-PAGE凝胶进行电泳(电压80 V转120 V)，通过湿转法(电流250 mA，2 h)将靶蛋白转移至PVDF膜上，用5 g·L-1脱脂牛奶室温下封闭2 h，加入相应的一抗，置于4 ℃冰箱孵育过夜。第2天，经二抗室温孵育2 h后，于暗室内进行显影。以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。
1.2.6 qRT-PCR检测HMGB1 mRNA的表达情况采用Trizol法提取细胞总RNA。按照逆转录试剂盒说明书逆转录cDNA。以β-actin为内参，比较各组细胞HMGB1和β-actin的Ct值，采用2-△△Ct分析HMGB1 mRNA表达情况。HMGB1基因序列：正向为5’-GAGCATAAGAAGAAGCACCCAGAT-3’，反向为5’-GGGCGATACTCAGAGCAGAAG-3’；
β-actin基因序列：正向为5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，反向为5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。
1.2.7 TUNEL法检测细胞凋亡情况将细胞接种于预先放置细胞爬片的24孔板中，每孔2×104个细胞。用40 g·L-1多聚甲醛室温固定1 h，冰上静置细胞5 min。按说明书要求配置TUNEL检测液。每孔加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃孵育1 h。加入经PBS稀释的Hoechst，室温避光孵育8 min。用封片剂封片，在荧光显微镜下进行拍摄。
1.3 统计学方法采用Graphpad Prism 9.0软件进行统计学分析并绘制图表。数据以均数±标准差表示。两组间样本比较采用独立样本t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2.1 各组晶状体前囊膜和SRA01/04细胞HMGB1蛋白的表达Western blot检测结果显示：DC组患者晶状体前囊膜HMGB1蛋白相对表达量为1.18±0.02，高于ARC组(1.00±0.02)，差异有统计学意义(P<0.001)(图1)；
高糖组SRA01/04细胞中HMGB1蛋白相对表达量同样高于正常糖组，差异有统计学意义(P<0.001)(图2)。
2.2 HMGB1敲降效率的验证qRT-PCR检测结果显示：si-HMGB1组SRA01/04细胞HMGB1 mRNA相对表达量显著低于scr-siRNA组，差异有统计学意义(P<0.001)；
正常对照组和scr-siRNA组之间差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。
图1 两组患者晶状体前囊膜HMGB1蛋白的表达情况 两组相比，***P<0.001。
图2 两组SRA01/04细胞HMGB1蛋白的表达情况 1表示正常糖组，2表示高糖组；
两组相比，***P<0.001。
图3 各组SRA01/04细胞HMGB1 mRNA相对表达量 两组相比，***P<0.001，ns表示P>0.05。
2.3 HMGB1敲降后对高糖诱导的SRA01/04细胞凋亡和自噬的影响
2.3.1 HMGB1敲降后可抑制高糖诱导的SRA01/04细胞凋亡为了探讨HMGB1在高糖诱导的SRA01/04细胞凋亡中的作用，本研究采用Western blot检测凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达变化。结果显示，高糖组SRA01/04细胞中促凋亡蛋白Bax的表达水平高于正常糖组，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平低于正常糖组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。敲降HMGB1后，高糖+si-HMGB1组SRA01/04细胞中Bax的表达水平低于高糖+scr-siRNA组，而Bcl-2表达水平高于高糖+scr-siRNA组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4)。TUNEL实验进一步验证，抑制HMGB1的表达可减少高糖诱导的SRA01/04细胞凋亡(图5)。
图4 Western blot检测HMGB1敲降后各组SRA01/04细胞凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的表达 两组相比，*P<0.05，**P<0.01。1、2、3、4分别表示正常糖组、高糖组、高糖+scr-siRNA组、高糖+si-HMGB1组。
图5 TUNEL法检测HMGB1敲降后各组SRA01/04细胞凋亡情况(×100)
2.3.2 HMGB1敲降后可抑制高糖诱导的SRA01/04细胞自噬为了研究HMGB1在高糖诱导的SRA01/04细胞自噬中的作用，本研究同样采用Western blot检测自噬相关蛋白(LC3II和p62)的表达变化。结果显示：高糖组SRA01/04细胞LC3II的表达水平高于正常糖组，而p62的表达水平低于正常糖组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；
HMGB1敲降后，高糖+si-HMGB1组SRA01/04细胞LC3II的表达水平低于高糖+scr-siRNA组，而p62的表达水平高于高糖+scr-siRNA组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图6)。这提示HMGB1的减少可抑制高糖诱导的SRA01/04细胞自噬。
图6 Western blot检测HMGB1敲降后各组SRA01/04细胞自噬相关蛋白(LC3II和p62)的表达 两组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。1、2、3、4分别表示正常糖组、高糖组、高糖+scr-siRNA组、高糖+si-HMGB1组。
随着物质生活水平的提高，糖尿病患者人数呈逐年增长的趋势。人口老龄化以及患者预期寿命的延长意味着糖尿病的患病率到2050年将超过33%[10]。作为糖尿病最常见的眼部并发症之一，糖尿病性白内障的发病率也在逐年增高。流行病学调查显示，糖尿病患者白内障的患病率是正常人群的5倍，平均提前10年发病[11]。持续的高糖刺激可致晶状体在内的各种眼部组织发生病理学改变[12]。葡萄糖通过醛糖还原酶转化为山梨糖醇，却难以继续转变为果糖，由此形成的高渗环境诱导LEC发生一系列功能变化(凋亡和自噬等)，引起细胞肿胀，最终导致晶状体混浊[13-14]。因此，了解高糖对LEC生存的影响及其具体机制至关重要。在本研究中，我们以糖尿病性白内障患者和高糖条件下培养的SRA01/04细胞作为研究对象，旨在寻找能够防治糖尿病性白内障的潜在分子靶点。
HMGB1是一种高度保守的蛋白，广泛分布于心、脑、眼等组织中[15]。近年来，大量研究表明，HMGB1与糖尿病及其并发症密切相关。Yan等[16]研究发现，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者血清中的HMGB1表达更高。Wang等[17]通过大脑中动脉闭塞再灌注模型发现，与非糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠大脑中HMGB1的分泌增加，且缺血也可诱导糖尿病大鼠大脑分泌HMGB1，提示HMGB1有望成为糖尿病患者缺血后损伤的治疗靶点。Liang等[18]通过染色质免疫沉淀等体外实验证实，HMGB1与IκB相互作用，通过NF-κB通路参与糖尿病视网膜病变的进展。此外，作为一种与损伤相关的分子模式蛋白，HMGB1在糖尿病小鼠角膜中的表达显著升高，抑制HMGB1表达可促进糖尿病眼损伤后角膜上皮的恢复[19]。总之，以上结果均提示HMGB1在糖尿病的发病以及糖尿病并发症发生中发挥重要作用。而本研究发现，HMGB1在DC组和高糖组组织或细胞中表达均升高，提示HMGB1也可能参与调控糖尿病性白内障的发生发展。
细胞凋亡是一种由基因控制的，为维持内环境稳态的细胞程序性死亡过程。Liu等[20]研究发现，抑制HMGB1表达可通过激活AMPK通路和减轻线粒体功能障碍来减少高糖诱导的骨髓基质细胞凋亡。Jiang等[21]通过向链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠玻璃体内注射HMGB1 siRNA发现，视网膜内皮细胞凋亡减少，视网膜功能得以改善。这些结果表明，HMGB1表达下调可能对细胞起一个保护性作用。在本研究中，我们发现高糖可促进SRA01/04细胞凋亡，而HMGB1敲降后细胞凋亡减少，提示HMGB1表达下调能显著抑制高糖介导的SRA01/04细胞凋亡。
自噬是细胞内受损蛋白或细胞器经自噬小泡包裹后送入溶酶体中进行降解的另一种细胞程序性死亡过程。研究显示，HMGB1介导的自噬可在不同的疾病中发挥不同的功能。例如，Chen等[22]发现，HMGB1的减少可通过抑制自噬通量来减轻糖尿病小鼠的心肌缺血-再灌注损伤。而Chung等[23]用英夫拉色烯抑制HMGB1表达，细胞自噬受到抑制，细胞功能发生障碍，继而引发糖尿病。由此可见，HMGB1介导的自噬具有双重作用。本研究结果显示，高糖可激活自噬，当抑制HMGB1表达时，自噬水平降低。此外，已有研究表明，细胞在应对外界应激时，凋亡和自噬之间的协同作用是维持细胞正常功能的重要机制[24]。过度自噬或毒性自噬可通过溶酶体释放促凋亡蛋白来加速细胞凋亡或通过组织蛋白酶增加线粒体膜通透性激活半胱天冬酶诱导的细胞凋亡。鉴于此，我们将在后续的实验中进一步探索HMGB1在高糖介导的SRA01/04细胞凋亡和自噬之间的具体调控机制。
综上所述，本研究结果显示，HMGB1可能通过调控LEC凋亡和自噬过程来参与糖尿病性白内障的发生发展，该结论有望为糖尿病性白内障发病机制和防治策略研究提供新的分子靶点。
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