刘治智 李 巍
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是排除酒精及其他明确的损肝因素以外，由脂质沉积在肝脏引起的一组临床综合征。一项关于NAFLD 的流行病学研究显示，其发病率高达30%，病情进展至晚期肝病的可能性极低，NAFLD 的死亡病例多死于冠心病（CHD）[1]。相关研究表明，CHD 是造成NAFLD 患者预后不良的重要因素，NAFLD 亦是导致CHD 发生、发展的危险因素[2]。因此，早期准确预测NAFLD 合并CHD 的发生，对于诊疗方案的制定具有重要的临床意义。外泌体miR-122 是一种富集在肝脏的新型细胞凋亡调控因子，能够调节血管内皮细胞功能，拮抗炎症反应和动脉粥样硬化[3]。国外研究显示，随着NAFLD 病情的进展，存在一定程度的肝组织损伤，影响外泌体miR-122 的生长，进而促进动脉粥样硬化进展[4]。对此，本研究目的在于分析血清外泌体miR-122 与NAFLD 合并CHD 的关系，期望为疾病的诊治及预防提供依据。
1.1 一般资料 选择浙江台州恩泽医疗（集团）恩泽医院消化内科2019 年1 月至2022 年1 月接诊的200 例NAFLD 患者作为研究对象，根据是否合并CHD，分为NAFLD 组（115 例）和CHD 组（85 例），并选同期的100 例健康体检者作为对照组。本研究经医院伦理委员会审核（批准文号：伦审[2019]1 号）。
1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）年龄18～80岁；
（2）NAFLD 组和CHD 组患者符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 年更新版）》关于NAFLD的诊断标准[5]，CHD 组患者出现冠状动脉至少1 支主要分支血管的管腔直径狭窄程度超过50%；
（3）知悉研究内容，签署知情同意书，自愿入组，配合检查。排除标准：（1）长期饮食者；
（2）合并病毒性肝炎、药物性肝损伤、免疫性肝病者；
（3）患有难以控制的高血压、高血糖者。
1.3 检查方法 所有患者均在禁食12 h，于次日清晨空腹状态下抽取肘静脉血10 mL，分别放置于两支促凝采血管中，其中一支管用于检测生化指标，如空腹血糖（FBG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）。另一支管在室温下放置10 min，以3000 r/min 离心15 min，分离血清，使用普迈SBI ExoQuick 外泌体提取试剂盒提取血清外泌体，收集经PBS 缓冲液重悬沉淀的外泌体，通过透射电镜观察血清外泌体形态，在电镜视野下观察外泌体呈现圆形或椭圆形杯状结构，大小不均一，说明血清外泌体提取成功，用于后续检测血清外泌体miR-122 水平；
使用Trizol 法提取血清外泌体中RNA 并逆转录获得互补DNA；
采用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测血清外泌体miR-122 表达水平，RT-PCR引物由海冷泉生物科技有限公司提供，RT-PCR 反应条件为：95 ℃，10 min，进行40 个PCR 循环（95 ℃，10 s；
60 ℃，60 s），上游及下游引物序列分别为：5"-GTCGTCAGTGCATGACAGAACTT-3"，5"-GTGCAGGGTCCGAGGT-3"，以2-△△Ct计算外泌体miR-122 相对表达量。
1.4 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件分析数据，两组间符合正态分布且方差齐性的计量资料以均数±标准差（）表示，使用t 检验，三组间使用方差分析；
计数资料使用χ2检验；
使用多因素Logistic回归分析血清外泌体miR-122、BMI、ALT、LDL、HDL水平与单纯NAFLD 以及NAFLD 合并CHD 的相关性。NAFLD 组及CHD 组中血清外泌体miR-122 水平与BMI、FBG、ALT、AST、GGT、ALP、TG、LDL 和HDL的相关性应用Pearson 相关性分析方法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 对照组、NAFLD 组与CHD 组各项指标及外泌体miR-122 比较 各组一般资料比较、NAFLD 和CHD 的常规监测指标及外泌体miR-122；
NAFLD 组血清外泌体miR-122 水平在明显低于对照组（P＜0.05），CHD 组明显低于NAFLD 组（P＜0.05），见表1。
表1 三组各项指标及外泌体miR-122 比较（）
表1 三组各项指标及外泌体miR-122 比较（）
注：BMI 为体质指数；
FBG 为空腹血糖；
ALT 为丙氨酸氨基转移酶；
AST 为天门冬氨酸氨基转移酶；
GGT 为谷氨酰转肽酶；
ALP 为碱性磷酸酶；
TBIL 为总胆红素；
TG 为三酰甘油；
TC 为总胆固醇；
LDL 为低密度脂蛋白胆固醇；
HDL 为高密度脂蛋白胆固醇；
与对照组比较，aP＜0.05；
与NAFLD 组比较，bP＜0.05
2.2 外泌体miR-122 与NAFLD 的关系分析 以NAFLD（1=是，0=否）为因变量，以对照组与NAFLD组比较且差异有统计学意义（P＜0.05）的指标为自变量，包括BMI、FBG、ALT、AST、GGT、ALP、TG、HDL、外泌体miR-122，以上述自变量≥中位数赋值为1，反之赋值为0。经多因素Logistic 回归分析，血清外泌体miR-122 与NAFLD 的发病风险相关（P＜0.05）；
见表2。
表2 外泌体miR-122 与NAFLD 的关系分析
2.3 外泌体miR-122 与NAFLD 合并CHD 的关系分析 以NAFLD 是否合并CHD（1=是，0=否）为因变量，以NAFLD 组与CHD 组比较且差异有统计学意义（P＜0.05）的指标为自变量，包括BMI、ALT、LDL、HDL、外泌体miR-122，以上述自变量≥中位数赋值为1，反之赋值为0。经多因素Logistic 回归分析，BMI、LDL 和血清外泌体miR-122 与NAFLD 合并CHD 的风险相关（P＜0.05）；
见表3。
表3 外泌体miR-122 与NAFLD 合并CHD 的关系分析
2.4 血清外泌体miR-122 与相关指标的相关性分析 经Pearson 相关性分析，NAFLD 组血清外泌体miR-122 水平与相关指标间均无相关性（P＞0.05）；
CHD 组血清外泌体miR-122 水平与BMI 及LDL 均呈负相关（P＜0.05）；
见表4。
表4 血清外泌体miR-122 与相关指标的相关性分析
研究显示，NAFLD 可能是动脉粥样硬化的指征之一，是早期CHD 的重要危险因素[6]。相关研究表明，外泌体miR-122 表达下降，可加剧肝脏脂肪沉积、肝脏炎症和纤维化[7-8]。也有研究显示，抑制脂肪肝大鼠模型体内外泌体miR-122 的表达，可使血浆胆固醇水平和脂肪肝程度升高[9]。本研究结果显示，NAFLD 组血清外泌体miR-122 水平明显低于对照组；
与章建伟等[10]研究发现NAFLD 患者血清外泌体miR-122 水平下调且与脂肪变性程度呈负相关的这一观点相吻合。究其原因，考虑在于外泌体miR-122缺乏可导致肝细胞脂质蓄积、炎症反应和氧化应激，使肝脏产生脂肪变性。与此同时，本研究结果显示，低外泌体miR-122 水平与NAFLD 发病风险的关系密切，从而进一步证实外泌体miR-122 低表达是NAFLD 发病的危险因素，为此病诊断、严重程度评估和分子靶向治疗提供线索。
目前认为，NAFLD 是机体代谢综合征的肝脏表现，由于代谢综合征往往包括糖尿病、高脂血症等CHD 危险因素，故可理解NAFLD 与CHD 互为因果、相互影响[11]。外泌体miR-122 被认为是CHD 的潜在生物标志物，郭伟崇等[12]研究显示，外泌体miR-122 水平与冠脉狭窄程度呈负相关。由此推测，外泌体miR-122 是CHD 的保护因子，NAFLD 合并CHD的风险受到外泌体miR-122 的影响，而外泌体miR-122 可能是NAFLD 与CHD 之间联系的纽带。本研究中CHD 组血清外泌体miR-122 水平明显低于NAFLD 组，预示着NAFLD 患者血清外泌体miR-122 水平降低，发生CHD 的风险随之增大。孙晓燕等[13]研究指出，外泌体miR-122 能拮抗血管炎症反应、抑制动脉粥样硬化、改善血管内皮功能和逆转心肌纤维化，亦支持本研究观点。与此同时，本研究使用多因素Logistic 回归分析，结果提示低外泌体miR-122 水平可能为NAFLD 患者发生CHD 的危险因素，为诊治NAFLD 合并CHD 提供新靶点，但仍需要进一步比较研究和扩大验证。
一直以来，临床学者不断致力探讨NAFLD 引起CHD 的发生机制，NAFLD 患者往往存在胰岛素抵抗、脂代谢紊乱等危险因素，引起CHD 的重要原因[14]。鉴于BMI、ALT、LDL 和HDL 均是评价NAFLD 严重程度的重要指标，亦与CHD 密切相关[15]。有理由认为，比较严重的NAFLD 患者更容易发生CHD，与肥胖、血脂代谢紊乱和肝功能受损有关。有研究发现，外泌体miR-122 低表达更是血脂异常和动脉粥样硬化的共同危险因素[16]。本研究Pearson 相关性分析，NAFLD 组血清外泌体miR-122 水平与相关指标间均无相关性；
而CHD 组血清外泌体miR-122 水平与BMI 及LDL 均呈负相关；
提示NAFLD 患者血清外泌体miR-122 水平与CHD 发生风险的关系是基于BMI 和LDL。分析可能原因是外泌体miR-122 低表达导致NAFLD 患者脂质代谢紊乱、氧化应激反应和炎症反应加剧，促使内皮功能紊乱，引起动脉粥样硬化，进而增大CHD 发生风险，通过靶向抑制外泌体miR-122 表达可能是NAFLD 合并CHD 的潜在治疗策略，有望增加患者的临床获益。
综上所述，外泌体miR-122 在NAFLD 患者血清中呈低表达，外泌体miR-122 低表达不仅是NAFLD的危险因素，可能也增加NAFLD 合并CHD 的风险，有希望成为评估NAFLD 合并CHD 病情的分子标志物，值得进一步研究应用。当然，本研究也存在不足之处，如仅以肝脏彩超检查结果作为诊断NAFLD 的论据，缺乏肝脏穿刺活检结果，未将单纯CHD 组进行对照研究，导致研究结果存在一定偏倚，有待日后从基础研究角度展开，扩大临床研究规模，深入分析外泌体miR-122 在NAFLD 和CHD 发生、发展中的作用机制。
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