张 磊， 刘砾子， 黄显章， 高 丽， 李 超， 周 彪
(1.青海省干旱浅山造林试验站 青海 西宁 810008；
2.南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点试验室 河南 南阳 473004)
西红花为鸢尾科番红花的干燥柱头，香气馥郁。其性平、味甘，归心、肝经，有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的作用，适用于经闭、产后瘀滞、热毒、抑郁、惊厥等[1，2]。研究表明西红花所含有的主要活性物质为苦番红花素、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ，其中苦番红花素是其苦味的物质基础，而西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ是其色泽的基础，这3个成分通常被用来衡量其质量优劣[2-11]。《中华人民共和国药典》2020年版(一部)以苦番红花素含量、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量之和作为评价指标，对其品质进行了初步分析[1]。
西红花主要产于伊朗、印度、西班牙。西红花在1700多年前通过印度传入西藏，所以被称为“藏红花”。上海崇明、浙江、江苏、河南南阳和许昌等地已形成了一定的种植规模。近些年，青海开始引进种植，但是其有效成分含量尚未有相关试验。本试验基于药典方法，测定青海产西红花中3个有效成分的含量，初步评价其质量，以期为青海产西红花的质量控制提供基础数据。
1.1 仪器
本试验所用的主要仪器信息见表1。
表1 试验所用仪器相关信息
1.2 材料
3个对照品均由成都格利普生物科技有限公司提供：苦番红花素(纯度>98.79%、批号19092701)，西红花苷-Ⅰ(纯度>98.00%、批号17121301)，西红花苷-Ⅱ(纯度>98.00%, 17121107)。乙腈(色谱纯、天津市科密欧化学试剂有限公司)，水(纯净水、华润怡宝饮料有限公司)，其他均为分析纯。3批西红花样品均产自青海，经本课题组黄显章教授鉴定为正品。
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent EclipseXDB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；
在表2中给出了梯度洗脱的特定条件。在表2所示色谱条件下进样，3个有效成分的峰型较好，杂峰干扰小，分离度优良。苦番红花素在15 min左右出峰，西红花苷-Ⅰ在31 min左右出峰，西红花苷-Ⅱ在37 min左右出峰。
表2 色谱条件
2.2 对照品溶液的制备
准确称取各对照品的粉末，加入25 mL棕色容量瓶，加入稀释的乙醇，使其混合均匀，获得混合对照品溶液(苦番红花素、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的浓度依次为240 μg·mL-1、320 μg·mL-1、240 μg·mL-1)。封口膜密封，避光保存。对照品色谱图如图1所示。
1.苦番红花素；
2.西红花苷-Ⅰ；
3.西红花苷-Ⅱ
2.3 供试品溶液的制备
将干燥的西红花样品粉碎，过三号筛。然后，准确称量10 mg的粉体，然后倒入50 mL棕色容量瓶，加适量稀释的乙醇，冰浴超声20 min。冷却到室温后，加入稀释的乙醇至刻度，摇匀，用一次性无菌注射器抽取样品溶液，使用0.22 μm过滤器过滤至样品瓶中，即得。样品色谱图如图2所示。
1.苦番红花素；
2.西红花苷-Ⅰ；
3.西红花苷-Ⅱ
2.4 线性关系考察
取配制的对照品溶液0.05 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入稀释的乙醇，以获得不同浓度的对照溶液，然后进行样品分析。标准曲线是以有效组分的浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标。结果显示：3种有效组分的峰面积均与其浓度有较好的线性关系(见表3)。
表3 线性关系考察结果
2.5 精密度试验
用一组对照溶液进行6次测试，获得各有效组分峰面积的 RSD。3个有效成分峰面积的RSD依次为：苦番红花素为0.30%、西红花苷-Ⅰ 为1.14%、西红花苷-Ⅱ 为1.91%。结果显示，该测试设备具有较高的精度。
2.6 稳定性试验
精确称取10 mg西红花的粉末，按2.3节中列出的步骤配制试样溶液，依次在0、2、4、6、8、12 h测定含量，求各有效成分峰面积的RSD值。由结算结果可知，3种活性组分峰面积的RSD依次为：苦番红花素0.29%、西红花苷-Ⅰ 1.47%、西红花苷-Ⅱ 0.64%，表明供试品溶液避光保存12 h内各指标成分稳定性良好。
2.7 重复性试验
将6份10 mg的西红花粉末精密称重，按2.3节中列出的方法配制试样溶液，进仪器测试，求各有效成分含量的RSD。结果显示所测样品中3个有效成分含量的RSD依次为：苦番红花素1.98%、西红花苷-Ⅰ 1.06%、西红花苷-Ⅱ 1.75%，表明本研究具有较好的重现性。
2.8 加样回收率试验
取6份5 g左右的西红花粉末精确称重，将其置于50 mL容量瓶中，加入适当的对照溶液，并用超声波进行处理，然后进样检测，并计算其回收率(见表4)。3个有效成分的平均回收率和RSD分别为：苦番红花素98.71%、1.38%，西红花苷-Ⅰ 98.91%、1.91%，西红花苷-Ⅱ 100.10%、1.51%，表明该方法准确度良好。
表4 加样回收率试验结果
2.9 样品含量测定
分别称取收集的3批青海产西红花样品粉末约10 mg，按2.3节中列出的方法配制试样溶液，然后进行样品分析，计算3个有效成分的含量及RSD(见表5)。
表5 青海产3批西红花药材中3个有效成分的含量测定结果(n=3)
3.1 检测波长和波长切换时间点的选择
3种主要组分的最大吸收波长不同(苦番红花素：254 nm；
西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ：440 nm)，不能用某单一波长同时检测3个有效成分[12，13]，故选择采用波长切换法同时测定3个有效成分的含量。通过试验可知，苦番红花素最先出峰，在15 min左右出峰，西红花苷-Ⅰ在31 min左右出峰，在15～31 min范围内的中间时间点切换波长比较适宜，因此选择23 min作为波长切换时间点，即0～23 min，254 nm；
23～50 min，440nm。
3.2 流动相的选择
结合参考文献[14-25]和药典[1]，最终选择梯度洗脱法同时测定西红花中3个有效成分的含量。在优选的条件下，本试验所需的3个有效成分峰均能与杂质分离，峰型良好，分离度高。
3.3 提取溶剂和时间的选择
本研究采用超声波法提取西红花样品中的有效成分，对不同浓度的甲醇、乙醇进行了比较，并研究了超声时间对提取效率的影响[18-29]。结果显示，效果最佳的条件是：溶剂为稀乙醇，超声处理时间为20 min。故本试验以稀乙醇为溶剂，超声20 min处理样品以获得供试品溶液[18-26]。
3.4 西红花样品中3个有效成分含量分析
2020年版《中华人民共和国药典》(一部)规定西红花药材中苦番红花素的含量不得少于5.0%，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总量不得少于10.0%[1]。青海3批西红花样品中3个有效成分含量都超过了药典的最低限定，各批次之间的含量差别较小。值得注意的是，3批西红花中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总量均超过药典标准的2倍，二者含量之所以较高，可能与青海番红花的种植方式、土壤、气候等环境因素相关，其积累与变化规律还需深入试验[14-29]。
西红花是一个传统药食两用物质，具有多种生理功能，有着很好的应用前景[11]。一方面，它可用于医治心脑血与神经系统退行方面的疾病；
另一方面，在食品加工中，它被用作茶饮品、色素、香料等。2015年版药典只把西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ作为西红花药材质量控制的指标成分是有一定局限性的。然而西红花所含化学成分十分复杂，其质量的优劣是多个成分综合表现出来的整体效应。为了系统地对西红花药材进行质量评价，有必要将西红花的苦味成分(主要是苦番红花素)的含量测定纳入西红花药材质量评价的指标体系中。2020年版药典规定了西红花药材中苦番红花素、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的总量的最低限度。因此，本试验依据2020年版药典，以苦番红花素、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ为指标成分，同时测定了青海产西红花中3个有效成分的含量。结果表明，青海产西红花质量优良，为青海发展西红花产业奠定了理论基础。