吴 宝，白玉勤，李丹丹，杨占民，孔凡龙
(1．赤峰学院基础医学院组织胚胎学教研室，内蒙古 赤峰 024000；
2．赤峰市肿瘤医院/赤峰学院第二附属医院病理科，内蒙古 赤峰 024000；
3．锦州医科大学，辽宁 锦州 121000)
大细胞肺癌(large cell lung cancer，LCLC)是肺癌的一种罕见的病理类型，占非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)的2%～3%[1]。与其他NSCLC相比，LCLC生长更快，转移更早，恶性程度较高[2]，5年存活率约为15%～25%[3]。血管生成因子如缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible-factor-1α，HIF-1α)在NSCLC中的表达和作用已有较多研究报道[4]，但是在LCLC中尚未见相关研究。动物切除组织制作病理学标本过程中，因血流中断、化学固定、酒精脱水步骤，通常会导致组织收缩、分子易位和抗原封闭等形成人工假象(artifacts)[5]。由日本山梨大学大野伸一教授研制开发的活体冷冻技术(in vivocryotechnique，IVCT)是在活体状态下冷冻固定动物靶器官，可揭示血液流动状态下的组织细胞结构，克服了传统标本制作方法因血流中断带来的缺血缺氧等弊端[6]。2008年，我们利用IVCT技术在异种移植人NSCLC模型上首次清晰观察到血清蛋白分布，提出了肿瘤间质及细胞外基质的血清蛋白分布与其相对分子质量密切相关，揭示了功能性血管与IgM和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表达的关系[7-9]，提出了“功能性血管”概念，但尚未研究NSCLC组织中的功能性血管数目。HIF-1α蛋白作为血管生成因子，与肿瘤组织血管生成密切相关。在IVCT技术制备的标本上进行各种蛋白免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)，染色结果尤为清晰、准确定位。为了研究LCLC中功能性血管与HIF-1α蛋白表达关系，本研究取大细胞肺癌Lu65和Lu99细胞移植瘤石蜡包埋组织，采用IHC法分析HIF-1α、VEGF、Ki67及血清蛋白Albumin、IgG、IgM的表达，旨在探讨Lu65和Lu99移植瘤组织中上述蛋白与功能性血管的关系。
1.1 实验动物及其移植瘤模型建立
1.1.1 实验动物本动物实验经日本山梨大学动物保护与使用委员会批准[8]。雄性BALB/c品系裸鼠(BALB/c-nu/nu)40只，购于日本SLC株式会社，鼠龄为7～8周，动物模型的建立和饲养均在日本山梨大学SPF级实验动物房中进行[7-9]。
1.1.2 肺癌细胞株大细胞肺癌Lu65和Lu99细胞株由日本东北大学生物医学研究所提供，在日本山梨大学医学部解剖分子教研室的细胞培养室常规传代培养[10]，两种细胞株均培养于含20%小牛血清的RPMI-1640培养液中。
1.1.3 肿瘤细胞移植采用细胞培养移植法，先进行Lu65和Lu99细胞培养并传代，收集约5×106个细胞接种到裸鼠背部皮下，方便观察肿瘤。接种后每周两次使用电子天平称量裸鼠体质量，观察裸鼠进食、饮水及肿瘤的生长情况，应用游标卡尺测量肿瘤长径和短径。计算肿瘤体积方法[8]：肿瘤体积=1/2×长径×短径2。待肿瘤体积达到1 000 mm3时进行病理形态学观察[8]。Lu65细胞移植后约15 d，Lu99细胞株移植后约30 d肿瘤体积达到了1 000 mm3。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 主要仪器设备牙科电钻，磁力搅拌器，低温冰箱，转轮切片机(莱卡，RM2235)，白色透明湿盒，五片直立瓶，罗纹口玻璃瓶，防脱片，显微镜(奥林巴斯，BX53)。
1.2.2 主要试剂鱼明胶购于Sigma公司；
羊抗鼠血清蛋白和免疫球蛋白G1和M(IgG1、IgM)购自美国Bethyl Laboratories公司；
兔抗人HIF-1α购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
VEGF和Ki67单克隆抗体购自迈新生物技术开发公司；
与一抗种属匹配的二抗兔抗羊IgG购自美国Vector Laboratories公司；
显色剂二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)试剂盒购自迈新生物技术开发公司。
1.3 标本的制备
活体冷冻固定移植瘤的步骤见图1。带有移植瘤的裸鼠用乙醚麻醉，剪开背部皮肤暴露移植瘤，用-196℃液氮致冷的异戊烷-丙烷冷冻液(-193℃)固定移植瘤制备标本[8]。在液氮中用牙科电钻取下移植瘤组织后，移到-80℃干冰预冷的2%多聚甲醛-丙酮液中进行冷冻置换[6]。冷冻置换是固定在2%多聚甲醛-丙酮液的冷冻标本从-80℃逐渐升温到室温的过程。移植瘤冷冻置换后用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物或石蜡包埋剂包埋，进行冰冻或石蜡切片，显微镜下观察。本项目主要观察移植瘤组织，转移瘤不在本次研究范围内。
图1 活体冷冻固定移植瘤模式图
1.4 免疫组织化学染色
石蜡标本3μm连续切片后贴附于含MAS的防脱载玻片。一部分切片进行苏木精-伊红(hematoxylineosin，HE)染色；
另一部分切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，最后蒸馏水水化后用PBS冲洗，用于IHC染色。IHC采用亲和素-生物素-过氧化物酶(ABC)法。首先用1%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性，2%鱼明胶溶液封闭。PBS漂洗3次，分别滴加一抗羊抗鼠血清蛋白Albumin、IgG1、IgM，兔抗人VEGF、HIF-1α和Ki67单克隆抗体，4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗后滴加二抗兔抗羊IgG或羊抗兔IgG，室温孵育1 h。DAB显色，采用苏木精进行细胞核淡染，梯度酒精脱水后中性树胶封片，显微镜下观察。每次染色均设空白对照(PBS)和自身阳性对照，自身阳性对照是在同一切片上与检测的目的物对照比较。如Albumin在血管腔内应为阳性，IgG1和IgM在某些免疫细胞浆或血管腔内应为阳性，HIF-1α在肿瘤细胞核内为阳性，EGFR在红细胞膜或某些梭形细胞浆应为阳性，Ki67在肿瘤细胞核应为阳性。
1.5 判断标准
在连续切片上对Lu65和Lu99细胞移植瘤组织(包括血管、癌间质、癌细胞外基质)的Albumin、IgG1和IgM蛋白免疫组化染色强弱程度进行统计，若观察到IgM蛋白免疫组化染色在血管腔内和其周围细胞外基质呈棕黄色着色，则判定为非功能性血管；
IgM蛋白免疫组化染色只是在血管腔内，其周围细胞外基质无棕黄色着色，判定为功能性血管，计数功能性血管和非功能性血管数量。VEGF蛋白免疫组化染色在胞膜或细胞浆呈棕色判断为阳性，无着色为阴性。HIF-1α在细胞核或浆呈棕色判断为阳性，无着色为阴性。Ki67在胞核呈棕色判断为阳性，无着色为阴性。光镜(200倍)下选择至少5个视野，按染色强度计分：无表达，0分；
浅黄色，1分；
棕黄色，2分；
黄褐色，3分。再按阳性率计分：阳性率=阳性表达细胞数/视野总细胞数×100%。阳性率=0，为0分；
0＜阳性率＜25%，为1分；
25%≤阳性率＜50%，为2分；
阳性率≥50%，为3分。评估标准：将染色强度评分和阳性率评分相加，按1～3分记为低表达；
4～6分记为高表达。
1.6 统计学分析
采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。移植瘤组织中的功能性血管和非功能性血管数目以±s表示，组间差异比较采用两样本独立t检验；
HIF-1α蛋白免疫组化染色阳性细胞数以例数及其比例表示，组间比较采用χ2检验(Fisher确切概率法)；
HIF-1α、VEGF及Ki67蛋白表达评分的相关性分析用Spearman秩相关进行分析；
P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2.1 Lu65和Lu99移植瘤组织形态学观察及HIF-1α蛋白的表达
Lu65和Lu99移植瘤组织连续石蜡切片的HE染色、HIF-1α蛋白免疫组织化学染色结果见图2。HE染色见Lu65移植瘤组织中部分区域细胞核碎裂、胞浆呈红染的坏死细胞形态。HIF-1α蛋白在Lu99移植瘤细胞核未见表达，呈阴性；
在Lu65移植瘤组织少许肿瘤细胞核呈浅黄色着色，为低表达。统计分析结果显示，HIF-1α蛋白在Lu65移植瘤组织中表达阳性率为100%，在Lu99移植瘤组织中表达阳性率为0，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。可见HIF-1α蛋白表达与Lu99和Lu65移植瘤肿瘤细胞异质性有关。
图2 Lu65和Lu99移植瘤组织HE染色和HIF-1α蛋白免疫组织化学染色后的病理组织学观察
2.2 VEGF和Ki67蛋白在Lu65和Lu99移植瘤组织中的表达及其与HIF-1α蛋白的相关性
Lu65和Lu99移植瘤组织VEGF、Ki67蛋白免疫组织化学染色结果见图3。VEGF免疫组化染色在移植瘤组织周围纤维结缔组织和间质内某梭形细胞膜阳性表达，血管内皮细胞和红细胞呈阳性表达，Lu65和Lu99移植瘤细胞浆呈阳性高表达。Ki67免疫组化染色在Lu65和Lu99移植瘤核呈阳性高表达。随机取20个Lu65和Lu99移植瘤组织石蜡标本HIF-1α与VEGF、Ki67蛋白表达的评分采用Spearman秩相关进行分析，得到HIF-1α蛋白表达与VEGF蛋白表达评分相关系数rs=0.042，P=0.86；
HIF-1α蛋白表达与Ki67蛋白表达评分相关系数rs=0.216，P=0.361。可见Lu65和Lu99移植瘤组织HIF-1α蛋白表达与VEGF和Ki67蛋白无明显相关关系。
图3 组织病理学观察LU65和LU99移植瘤组织中VEGF和Ki67蛋白的表达
2.3 Albumin、IgG1和IgM蛋白在移植瘤组织中的表达及功能性血管数目的统计分析
Lu65和Lu99移植瘤组织HE染色和Albumin、IgG1、IgM蛋白免疫组织化学染色结果见图4。在HE染色的移植瘤组织中观察到扩张的血管及血管内红细胞，并且在Lu65移植瘤组织中见部分区域细胞核碎裂、胞浆呈红染的坏死细胞形态。Albumin免疫组化染色在血管、细胞外基质呈强-中度阳性。IgG1免疫组化染色在血管和癌周围结缔组织呈中度阳性，在细胞外基质呈弱阳性。IgM免疫组化染色在血管和癌周围纤维结缔组织呈中度阳性，但是在大部分细胞外基质呈阴性，少部分细胞外基质呈阳性。Albumin、IgG1和IgM蛋白在Lu65移植瘤组织的片状坏死区呈非特异性着色(细胞核、细胞浆、细胞膜不清晰)。每张切片在200倍下随机选取5个视野观察血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)免疫组化染色表达部位，按方法中所述判断标准，统计功能性血管和非功能性血管数目，结果见图5。Lu65移植瘤组织的功能性血管数目为(7.80±1.03)条，非功能性血管数目为(1.20±0.92)条；
Lu99移植瘤组织的功能性血管数目为(6.90±0.99)条，非功能性血管数目为(0.80±0.63)条。Lu65和Lu99移植瘤组织中功能性血管数目均高于非功能性血管(均为P＜0.05)。
图4 Lu65和Lu99移植瘤组织HE染色和albumin、IgG1、IgM蛋白免疫组织化学染色结果
图5 Lu65和Lu99移植瘤组织中功能性血管和非功能性血管数目的比较
LCLC已被世界卫生组织列为重要肺癌亚型[11]，其发病率较其他类型的肺癌为低，误诊率高，且预后较差。LCLC预后差的主要原因是肿瘤细胞的快速生长、侵袭和转移。肿瘤微血管形成在LCLC细胞生长和转移过程中起到重要作用[12]。肿瘤血管生成与血管生成因子(VEGF和HIF-1α等)密切相关。我们研究证明了Lu99和Lu65移植瘤组织VEGF强阳性区域的血管壁不能透过大分子IgM，发现了NSCLC(包括LCLC)组织的功能性血管，并且功能性血管通透能力与血清蛋白相对分子质量密切相关[8]。HIF-1α是HIF-1的一个活性亚基，是含有碱性的螺旋-环-螺旋(bHLH)构型和Per/Amt/Sim(PAS)结构的异源性二聚体(bHLH-PAS)，是第1个被证实参与VEGF转录调控的转录因子，与肿瘤血管生成等密切相关[13]。在非小细胞肺癌中，HIF-1α蛋白表达与肺鳞状细胞癌和腺癌组织的血管形成密切相关[4]。在前列腺癌组织中HIF-1α蛋白表达与肿瘤恶性程度和预后密切相关，分化差(高级别)的前列腺癌组织中高表达HIF-1α蛋白，并且VEGF和HIF-1α蛋白表达呈正相关[14-15]。另外，HIF-1α还与乳腺癌患者的预后密切相关，HIF-1α阴性患者的病理完全缓解率显著高于HIF-1α阳性患者[16]。在这些肿瘤中，HIF-1α的过度表达可能与肿瘤缺氧性质、HIF-1α异常激活、肿瘤高度侵袭性有关[17]。本研究显示Lu65移植瘤组织的HIF-1α低表达，Lu99移植瘤组织细胞不表达。另外，移植瘤组织间质的淋巴细胞和某些巨噬细胞HIF-1α蛋白阳性表达，这与文献报道结果相同[18]。在Lu99和Lu65移植瘤组织中HIF-1α蛋白不表达或低表达与VEGF和Ki67蛋白是否表达及肿瘤细胞坏死形态无明显相关。统计分析HIF-1α蛋白在Lu99和Lu65移植瘤组织的表达量，不仅在不同细胞株(Lu65和Lu99)移植瘤组织之间有差异，而且在相同细胞株(Lu65)移植瘤组织之间有差异，故我们推测在Lu99和Lu65移植瘤组织中HIF-1α蛋白表达有可能与肿瘤细胞异质性有关。
本课题组此前研究报道了A549移植瘤侵袭组织与不同分子质量血清蛋白(Albumin、IgG1、IgM)表达有关[19]，还与Ki67蛋白表达有关，但是与VEGF和EGFR表达无明显相关[20]。已有研究发现NSCLC组织的功能性血管通透性与血清蛋白的分子质量密切相关[7-9]，包括LCLC(Lu65和Lu99)组织。大多数研究报道认为肿瘤血管生成与HIF-1α蛋白密切相关[14，21]。本研究采用报道[19，22]的半定量统计分析方法，对Lu65和Lu99细胞株移植瘤血清蛋白免疫组化染色强度进行了半定量分析，发现功能性血管与非功能性血管的周围移植瘤间质、细胞外基质中的血清蛋白(IgG、IgM)呈不同强度表达，说明了Lu65和Lu99细胞株移植瘤组织的血管通透性与血清蛋白相对分子质量和血管结构有关，也可能与VEGF蛋白表达强弱有关[8]，但是与HIF-1α蛋白表达无明显相关。另外，本研究首次发现了Lu65和Lu99细胞株移植瘤组织的功能性血管数目高于非功能性血管的研究成果，这一结果可能对肿瘤基础研究和临床肿瘤治疗有重大意义。
综上所述，IVCT技术制备的Lu65和Lu99细胞株移植瘤石蜡标本采用免疫组化染色分析HIF-1α、VEGF、Ki67和血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的表达，发现HIF-1α蛋白表达与VEGF、Ki67蛋白表达和肿瘤组织坏死形态无明显关，与Lu65和Lu99移植瘤细胞异质性有关。根据血清蛋白Albumin、IgG1、IgM的免疫组化染色表达强弱程度，提出功能性血管和非功能性血管的观点，并且Lu65和Lu99移植瘤组织中功能血管数目高于非功能血管。移植瘤组织的血管通透性与血清蛋白Albumin、IgG、IgM的相对分子质量和血管结构有关。
(感谢日本山梨大学医学部解剖分子组织学教研室大野教授大力支持)
猜你喜欢 胞外基质细胞株免疫组化 脱细胞外基质制备与应用的研究现状感染、炎症、修复(2021年1期)2021-07-28关于经络是一种细胞外基质通道的假说世界科学技术-中医药现代化(2020年2期)2020-07-25夏枯草水提液对实验性自身免疫性甲状腺炎的治疗作用及机制研究浙江医学(2020年9期)2020-07-01婴幼儿原始黏液样间叶性肿瘤一例及文献复习浙江中西医结合杂志(2019年4期)2019-05-05结直肠癌组织中SOX9与RUNX1表达及其临床意义浙江医学(2019年2期)2019-01-23斑蝥素酸镁对人肝癌细胞株SMMC-721转录组的影响中成药(2018年3期)2018-05-07子宫瘢痕妊娠的病理免疫组化特点分析中国继续医学教育(2015年1期)2016-01-06稳定敲低MYH10基因细胞株的建立医学研究杂志(2015年11期)2015-06-10Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达中国当代医药(2015年16期)2015-03-01稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH—7细胞株的建立中国医药导报(2015年27期)2015-02-28