尹丽萍，张剑林，殷 娜，黎进雪，王妍凌，达菊庆，李 宁，武 运
（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）
随着人们生活水平逐渐提高，人们对于健康更加关注，特别是对于乳品的营养及口感需求与日俱增[1-4]。发酵乳为乳和乳制品在特征菌的作用下发酵而成的酸性凝乳状制品[5]，具有改善乳糖不耐受的优势，同时具备抗有害微生物、抗胃肠感染、抗癌和降低血清胆固醇等功能[6-8]。益生菌在发酵乳发酵过程中发挥着重要的作用，赋予发酵乳独特风味[9-11]。由于发酵乳风味独特、质感细腻，受到更多消费者的青睐[12-14]。发酵乳衍生产品的感官品质及营养价值是广大消费者选择、购买和食用考虑的首要因素。因此，丰富发酵乳产品种类，提高其口感及食用价值是发酵乳的研究方向[15-16]。周洁等[17-18]研制了生姜红糖发酵乳与凝固型芝士风味发酵乳，徐华益[19]将白首乌添加到发酵乳制品，研制出既具有白首乌功能特性又具备发酵乳风味的白首乌发酵乳。
红葡萄酒粉主要由利用红葡萄酒（红酒）原汁及浓缩汁经喷雾干燥制备而成，粉末细致，颜色鲜艳、口味均匀、复水性好以及性状稳定。红酒风味乳制品是基于纯牛乳资源而开发的一种新型风味乳制品，阮雁春等[20]以红酒和全脂牛乳为主要原料制备了具有红酒和牛乳营养及风味的红酒酸奶产品，而红酒风味发酵乳的研究未见报道。红酒风味发酵乳制品的开发对于乳资源的扩展利用具有很大的现实意义，符合风味发酵乳产品多元化的趋势。红酒风味发酵乳既可以丰富发酵乳制品的种类，又可以发挥红酒粉与发酵乳的营养价值，改善人体肠道菌生活环境，容易人体消化吸收[21-23]，响应“健康、安全、绿色”的号召[24]。
本研究以牛奶与红酒粉为主要原料制备红酒风味发酵乳，以其酸度和感官评分为评价指标，在单因素试验基础上，采用模糊数学综合评价法结合响应面法对红酒风味发酵乳发酵工艺条件进行优化。以期为红酒风味发酵乳的制作提供理论及实践依据，为风味发酵乳的研发及工业化生产提供指导。
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
生鲜牛乳：新疆乌鲁木齐；
红酒粉：上海德乐饮品有限公司；
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YL15：新疆农业大学食品科学与药学学院食品生物发酵与质量安全研究室保藏。
1.1.2 试剂
蔗糖、NaOH、七水硫酸钴（均为分析纯）：天津致远化学试剂有限公司；
酚酞（分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；
MRS肉汤培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
HR40-A2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；
PTX-FA210电子天平：福州华志科学仪器有限公司；
HWS-26型电热恒温水浴锅：光明医疗（北京）仪器厂；
LDZX-50KBS高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；
JM-L型胶体磨：诺尼轻工机械（上海）有限公司；
DHG-9140A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；
H2500R台式高速离心机：湘仪仪器（长沙）有限公司；
MJX-100B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.3 试验方法
1.3.1 红酒风味发酵乳的加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料的调配：向生鲜牛乳中添加3%的红酒粉、6%的蔗糖进行调配。
均质：温度60～75 ℃，均质压力18～20 MPa下均质300 s。
杀菌：于恒温水浴锅中85 ℃加热20 min进行巴氏杀菌，冷却至室温。
菌种的活化：将单菌落挑至10 mL MRS肉汤培养基中37 ℃静置培养24 h。
接种：将活化好的植物乳杆菌YL15菌液以4℃、5000r/min离心15 min，取其沉淀用已灭菌蒸馏水进行洗涤后再次离心，重复2次后，加入已灭菌的蒸馏水制成菌悬液，以2%的接种量接种至冷却后混合原料中。
发酵、灌装：于42 ℃发酵5 h，凝固后进行灌装，即得红酒风味发酵乳成品。
1.3.2 红酒风味发酵乳发酵条件优化单因素试验
固定发酵基础条件为：接种量3%、发酵温度42 ℃、发酵时间5 h、蔗糖添加量6%、红酒粉添加量3%。以酸度及感官评分为评价指标，分别考察发酵时间（4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）、发酵温度（33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、红酒粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%）对红酒风味发酵乳发酵效果的影响。
1.3.3 红酒风味发酵乳发酵条件优化响应面试验
根据单因素试验结果，固定接种量为2%，蔗糖添加量为6%，分别以酸度（Y1）、感官评分（Y2）为响应值，以红酒粉添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，通过Box-Behnken原理进行3因素3水平的响应面试验设计。Box-Behnken试验设计因素和水平见表1。
表1 发酵条件优化Box-Behnken试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests of fermentation conditions optimization
1.3.4 感官评价
请20名专业感官评价员对红酒风味发酵乳的色泽、口感、组织形态、香气4个指标进行感官综合评价，满分100分，红酒风味发酵乳感官评价标准见表2。
表2 红酒风味发酵乳感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of red wine flavored fermented milk
1.3.5 模糊数学综合评价模型的建立
根据表2，参照张剑林等[25]的方法对不同条件下红酒风味发酵乳的感官指标进行模糊数学综合评价，并建立评价模型。
（1）对象集、因素集、得分集与权重集的建立
评价对象集U，代表进行感官评价的红酒风味发酵乳样品集合。U={u1，u2，u3，u4，u5，u6，u7，u8，u9，…uj…，u17}，其中，j=1，2，3，4，5，6，7，8，9，……，17。
评定因素集R={v1，v2，v3，v4}，v1～v4依次代表评价红酒风味发酵乳的4个评价因素。即R={色泽，口感，组织形态，香气}。
评价得分集B={b1，b2，b3，b4}，b1～b4依次代表优、良、中、差4个等级评判结果，对应的分值是90，80，70和60。即B={优，良，中，差}={90，80，70，60}。权重集X={x1，x2，x3，x4}，根据表2设置权重X={0.2，0.3，0.2，0.3}。
（2）模糊矩阵的建立及评价结果的确定
请20名专业感官评价员按照红酒风味发酵乳的色泽、口感、组织形态、香气4个因素进行感官综合评价，评价之后可统计各个因素在各个等级中的票数，然后根据所得的票数结果得红酒风味发酵乳的感官评价模糊关系矩阵Rk。
其中k=1，2，3，4，5，…17为样品的编号，里面的每一行都代表每一个质量因素的评价数据结果。然后依照红酒风味发酵乳模糊数学评价模型Tk=X×Rk（其中T评价集，X为权重系数，R为模糊矩阵）对第k号样品的感官评分进行计算。
1.3.6 分析检测
酸度的测定：参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[26]。
1.3.7 数据分析
采用Excel2019进行数据分析，使用软件Origin8.0绘图，采用Design-Expert 8.0.5进行响应面优化试验。
2.1 红酒风味发酵乳发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 发酵时间对红酒风味发酵乳品质的影响
由图1可知，当发酵时间＜5 h时，酸度及感官评分均逐渐增加；
当发酵时间为5 h时，酸度及感官评分均达到最大值，分别为82.1°T、88.4分；
当发酵时间＞5 h之后，酸度及感官评分均下降。综合考虑，确定最适发酵时间为5 h。
图1 发酵时间对红酒风味发酵乳品质的影响Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of red wine flavored fermented milk
2.1.2 发酵温度对红酒风味发酵乳品质的影响
由图2可知，当发酵温度＜42 ℃时，酸度及感官评分逐渐增加；
当发酵温度为42 ℃时，酸度及感官评分达到最大值，分别为87.1°T、88.7分；
当发酵温度＞42 ℃之后，酸度及感官评分下降。综合考虑，确定最适发酵温度为42 ℃。
图2 发酵温度对红酒风味发酵乳品质的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of red wine flavored fermented milk
2.1.3 接种量对红酒风味发酵乳品质的影响
由图3可知，当接种量＜2%时，酸度及感官评分均逐渐增加；
当接种量为2%时，酸度接近最高值且感官评分达到最大值，分别为75.1°T、89.2分；
当接种量＞2%之后，酸度及感官评分均下降。综合考虑，确定最适接种量为2%。
图3 接种量对红酒风味发酵乳品质的影响Fig.3 Effect of inoculum on the quality of red wine flavored fermented milk
2.1.4 蔗糖添加量对红酒风味发酵乳品质的影响
由图4可知，当蔗糖添加量＜6%时，红酒风味发酵乳酸度及感官评分逐渐增加；
当蔗糖添加量为6%时，酸度及感官评分均达到最高值，分别为75.2°T、88.7分；
当蔗糖添加量＞6%之后，酸度及感官评分呈下降趋势。综合考虑，确定最适接种量为6%。
图4 蔗糖添加量对红酒风味发酵乳品质的影响Fig.4 Effect of sucrose addition on the quality of red wine flavored fermented milk
2.1.5 红酒粉添加量对红酒风味发酵乳品质的影响
由图5可知，当红酒粉添加量＜3%时，酸度及感官评分均逐渐增加；
当红酒粉添加量为3%时，酸度及感官评分均达到最高值，分别为80.7°T、89.1分；
当红酒粉添加量＞3%之后，酸度及感官评分均逐渐下降。综合考虑，确定最适红酒粉添加量为3%。
图5 红酒粉添加量对红酒风味发酵乳品质的影响Fig.5 Effect of red wine powder addition on the quality of red wine flavored fermented milk
2.2 模糊数学综合评价法分析
20名感官评定人员对17组样品进行感官评定打分，各个等级的各项指标票数统计结果见表3。
将表3中的数据建立模糊评价矩阵，将每个样品的各自影响因素的得票数除以总的参与评价人数20，即可得到各个模糊矩阵R1～R17。以1号产品为例，色泽的评价人数分别为：0人优，7人良，10人中，3人差，则R色泽=（0.00，0.35，0.50，0.15），同理，R口感=（0.00，0.25，0.40，0.35），R组织形态=（0.00，0.30，0.40，0.30），R香气=（0.00，0.15，0.40，0.45），由此得矩阵R1：
表3 红酒风味发酵乳感官评分投票结果Table 3 Voting results of sensory scores of red wine flavored fermented milk
同理，可依次得到R2～R17。
根据模糊变换原理，利用矩阵乘法，将权重集合X乘以模糊数学关系矩阵Rj，可以得到样品对4个因素的综合隶属度Tk，以1号样品为例，综合隶属度T1如下：
同理，可得其他红酒风味发酵乳样品的模糊评价结果，将各个样品的综合评判结果分别乘以其对应的分值（优、良、中、差依次被赋予分值90分、80分、70分、60分），经过加和后，即得每个样品最终感官评分。如1号样品最终感官评分=0.00×90+0.25×80+0.42×70+0.33×60=69.2分。同理，可以计算出2～17号样品的感官评分。
2.3 红酒风味发酵乳发酵条件优化响应面试验结果
2.3.1 响应面试验结果与分析
响应面试验设计及结果见表4，方差分析见表5。通过Design-Expert 8.0.5软件对表4的试验结果进行拟合分析，可得到红酒风味发酵乳酸度（Y1）、感官评分（Y2）对红酒粉添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）的拟合回归方程为：
表4 发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization
续表
表5 回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model
由表5可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05）。决定系数R21=0.981 8，R22=0.998 5，调整决定系数R2Adj1=0.958 5，R2Adj2=0.996 6，该模型分别能解释95.85%、99.66%的变化，表明实测值与预测值间拟合度比较好。因此，能用该模型对红酒风味发酵乳的发酵条件进行分析和预测。
由P值可知，一次项A、B、C、交互项BC、二次项A2、B2、C2对酸度影响极显著（P＜0.01），交互项AB、AC对酸度影响显著（P＜0.05）；
一次项A、B、C与交互项AB、AC及二次项A2、B2对红酒风味发酵乳感官评分影响极显著（P＜0.01）。
2.3.2 响应面交互作用分析
由图6可知，发酵温度（B）和红酒粉添加量（A）、发酵时间（C）和红酒粉添加量（A）、发酵时间（C）和发酵温度（B）交互作用对酸度影响的等高线呈椭圆形，表明各因素之间的交互作用对酸度影响显著（P＜0.05）。发酵温度（B）和红酒粉添加量（A）、发酵时间（C）与红酒粉添加量（A）交互作用对感官评分影响的等高线呈椭圆形，表明各因素间交互作用对感官评分影响显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对红酒风味发酵乳酸度及感官评分影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on acidity and sensory scores of red wine flavored fermented milk
2.3.3 模型验证
经过Design-Expert8.0.5分析可得红酒风味发酵乳的最佳发酵工艺条件为：发酵时间5.1 h，红酒粉添加量3%，发酵温度42.3 ℃。在此最佳发酵工艺条件下，红酒风味发酵乳酸度预测值可达78.7°T，感官评分预测值为89分。为方便实际操作，将发酵工艺条件修正为：发酵时间5 h，红酒粉添加量3%，发酵温度42 ℃。在此优化条件下进行验证试验，重复3次，实际测得的酸度为78.3°T、感官得分为89分，与响应面法预测酸度及感官得分基本保持一致，该模型与实际试验结果拟合度较好，证实该模型具有一定的可行性。
以牛奶和红酒粉为主要原料制备红酒风味发酵乳，以酸度和感官评分为评价指标，在单因素试验的基础上，采用模糊数学综合评价法结合Box-Behnken法获得红酒风味发酵乳的最佳发酵工艺条件为：红酒粉添加量3%、发酵温度42 ℃、发酵时间5 h、接种量2%、蔗糖添加量6%。在该优化发酵工艺条件下，红酒风味发酵乳的酸度为78.3°T，感官评分为89分，红酒风味发酵乳色泽淡红，入口柔绵，有独特红酒香味。
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