杨佳鹏 谢梁震 王宇 常雪岩 刘静丹 韩德录 李宝华 周凌
慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉（CRSsNP）系耳鼻喉科临床常见病，鼻黏膜是上呼吸道抵御各种病原体入侵的第一关，当鼻腔黏膜的屏障功能受损，会使得各种致病因子更容易入侵出现黏膜炎症，进而导致CRSsNP。该病属中医“鼻渊”病范畴，以肺脾气虚型居多，以其复杂的发病机制和中医辨证时虚实夹杂的病变特点，一直是学者研究的热点。故本研究以肺脾气虚型CRSsNP为研究载体，寻找肺脾气虚型患者鼻黏膜特异性代谢产物的变化，进一步揭示“益气通窍饮”可能的疗效机制。
1 临床资料
研究对象来源于2019年4月～2021年10月黑龙江中医药大学附属第一医院，年龄18～65岁之间。辨证为肺脾气虚型CRSsNP者40例为观察组（脱落8例），男性11例、女21例，平均年龄（39.56±14.33）岁；
对照组20例，来自于体检中心的健康志愿者，男性9例、女性11例，平均年龄（38.30±12.96）岁。两组性别、年龄相均无统计学差异（P＞0.05）。纳入研究对象期间，须清淡饮食，减少不良刺激，如疲劳、熬夜、情绪激动，该研究经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会评议通过（HZYLLBA201807），所有志愿者均签署知情同意书。
2 CRSsNP诊断标准
2.1 西医诊断标准
参照《中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南（2018）》[1]诊断为不伴鼻息肉慢性鼻-鼻窦炎（CRSsNP），患者出现鼻塞、流浊涕、头面部胀痛、嗅觉减退等症状6个月～5年；
检查见中鼻道、嗅裂有粘性或粘脓性分泌物，鼻腔黏膜充血肿胀或肥厚，中鼻甲肿大或肥大；
鼻窦CT 扫描见窦腔密度增高影或液平。
2.2 中医诊断标准
参照《中医耳鼻咽喉科常见病诊疗指南》[2]鼻渊病（中国中医药出版社，2012）及《中医耳鼻咽喉科学》[（3]人民卫生出版社，2021）制定中医证候诊断标准。
肺脾气虚型：鼻塞，流白黏涕，嗅觉减退，头昏胀痛，气短乏力，自汗畏风，食少纳呆，脘腹胀满，舌质淡，苔薄白，脉细弱。鼻黏膜色淡红肿胀，中鼻甲肥大，中鼻道可见粘性分泌物。
2.3 CRSsNP纳入标准
①符合西医慢性鼻-鼻窦炎疾病诊断标准者；
②符合中医鼻渊肺脾气虚证候诊断标准者；
③年龄在18～65岁之间，男女不限。
2.4 CRSsNP排除标准
具备以下任何一项者均不能纳入。
①患有较严重的系统性疾病如肝肾功能不全、风湿病及孕妇；
②1个月内使用过抗生素、激素、微生态制剂；
3个月内使用过免疫制剂者；
③哮喘、过敏性疾病、真菌性鼻窦炎；
④不遵医嘱或研究过程记录不完整。
2.5 对照组纳入标准
①年龄在18～65岁之间，男女不限；
②经体检中心检查无代谢性疾病。
2.6 对照组排除标准
近1月服用抗生素、激素、微生态制剂，3个月内使用过免疫制剂者。
3 材料与方法
3.1 仪器与试剂
仪器设备：Thermo U3000液相色谱仪，Thermo QE-HF-X质谱仪，湘仪H1850-R冷冻离心机，IKA Vortex 2涡旋混匀仪。
试剂：Thermo色谱乙腈，Dikma色谱甲酸，Dikma色谱甲醇，超纯水（屈臣氏）。
益气通窍饮：党参12.5g、蜜炙黄芪12.5g、土炒白术12.5g、防风7.5g、辛夷10g、川芎10g、白芷10g、桔梗7.5g、炒苍耳子10g、桂枝7.5g、细辛2.5g、炙甘草5g，由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科统一制剂，制成100ml药液，灭菌后浓缩装入药品瓶。日1剂，每日早晚餐后30min温服，共计8周。
3.2 样本采集与制备
3.2.1 样本采集
对照组于入组时采集样本，观察组于入组治疗前、后分别采集样；
鼻腔黏膜钳取方法：以1%地卡因加少许肾上腺素棉片填塞患侧鼻腔，行鼻腔局部表面麻醉，在鼻内镜下，以麦粒钳于患侧中鼻甲根部钳取约0.5cm×0.5cm×0.5cm黏膜组织，随后以可溶性手术止血纱布敷于创面，检查无出血后术毕。
3.2.2 代谢组学样品制备
样本在4℃下融化，每个黏膜组织称重，加入9倍质量-20℃预冻色谱甲醇，冰浴研磨；
以12000r/min速度，4℃离心15min，取全部上清液，每个样本各取20μL混合成QC样本用以校正，剩余装入液相小瓶。
3.2.4 色谱条件
采用ACQUITY UPLCRHSS T3 1.8μm（2.1mm×150mm）色谱柱，自动进样器温度设为4℃，以0.4 ml/min的流速，40℃的柱温，进样10μL进行梯度洗脱，流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯 度 洗 脱：0min，1%A；
0~3min，1%~20%A；
3~5 min，20%~60%A；
5~9min，60%~100%A。
3.2.5 质谱条件
仪器使用电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为2.50kV，鞘气45arb，辅助气15arb。毛细管温度325℃，以分辨率60000进行全扫描，扫描范围50~1000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为15 V/30 V/45 V（多级模式），同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。
3.3 样本数据预处理
a.通过Progenesis QI软件（v2.3）导入样本原始下机数据，进行峰识别、峰过滤、峰对齐。
b.得到包括质核比、保留时间及峰面积等信息的数据矩阵，导出数据至excel进行分析。
c.为使不同量级的数据能够进行比较，对数据进行峰面积的批次归一化。
3.4 差异代谢物筛选将得到的数据矩阵导入EZinfo 3.0软件，进行多元统计分析，根据OPLS-DA分析确定每个离子的贡献值（VIP），结合组间T检验，对代谢物进行筛选。
3.5 差异代谢物鉴定
利用离子的母离子及碎片离子信息，通过HDMB代谢物信息库（20211024）利用Progenesis QI软件进行差异代谢物鉴定。
3.6 差异代谢物代谢通路分析
将鉴定的差异代谢组信息导入MetaboAnalyst5.0数据库，进行差异代谢物参与KEGG代谢通路分析。
图2 负离子下各组色谱图
1 代谢指纹图谱宏观分析
比较空白对照组、肺脾气虚组样本治疗前、后的典型离子色谱图，宏观上代谢指纹图谱有所差异，峰强度有一定差异，保留时间集中在0～15min（图1，2）。
图1 正离子下各组色谱图
2 鼻黏膜代谢组学分析
图4 鼻黏膜代谢组学PCA得分图-负离子模式
采用非监督主成分分析，正离子模型：R2=0.5184，Q2=0.4835，负离子模型：R2=0.7735，Q2=0.7326。如图3，4所示，肺脾气虚组治疗前与对照组可显著区分，无交叉重叠。
图3 鼻黏膜代谢组学PCA得分图-正离子模式（C-对照组；
M-观察组治疗前；
8Weeks-观察组治疗后）
3 差异代谢物的鉴定
图6 OPLS-DA负离子图（R2=0.7735，Q2=0.7326）
图7 正离子S-Plot图
图8 负离子S-Plot图
为进一步筛选组间差异性代谢产物，依据数据建立OPLS-DA模型，依据权重系数VIP＞1以及P＜0.05，肺脾气虚组治疗后与对照组未发现明显差异性代谢产物，肺脾气虚组治疗前与对照组代谢变化进行比较，共鉴定得到差异代谢物离子20个，见表1、图5-9。
图5 OPLS-DA正离子图（R2=0.7735，Q2=0.6138）
表1 主要差异代谢物
图9 差异性代谢产物组间差异
4 差异代谢物KEGG代谢通路
图10 ，通过MetaboAnalyst 5.0对差异表达代谢物进行KEGG富集分析，结果显示影响较大的代谢途径为：Arginine biosynthesis;Neomycin,kanamycin and gentamicin biosynthesis;Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis;D-Glutamine and Dglutamate metabolism;Nitrogen metabolism。
图10 KEGG代谢通路气泡图
基于UPLC-MS检测到肺脾气虚型CRSsNP存在代谢异常，而益气通窍饮治疗有着明显改善趋势，现对其调控机制作如下分析：
观察组中L-Arginine代谢水平的由低转高，LArginine介导淋巴细胞代谢途径，参与机体免疫调节、黏膜功能保护过程[3]，“益气通窍饮”可能通过提升L-Arginine代谢水平，上调免疫抑制来降低炎症反应。
L-Glutamine、Pyroglutamic acid、Phenylpyruvic acid、Glucose 6-phosphate、Hypoxanthine代谢水平均出现下调说明炎症导致机体抗氧化能力下降，而氧化应激和炎症是紧密相连的[4]，慢性炎症迁延不愈与炎性细胞产生活性氧有关，活性氧是许多细胞信号转导通路中的第二信使，与细胞增生、分化和凋亡有关[5]。机体抗氧化能力下降，随着过氧化物自由基生成的增多，也会加重慢性炎症反应[6]，而“益气通窍饮”通过抗氧化途径来减少炎性细胞因子。
Undecanedioic acid、L-Glutamine经过治疗后代谢水平由低转高，二者均与能量代谢相关，LGlutamine是免疫细胞重要的能量来源，代谢水平的减低会导致出现免疫抑制[7]；
Undecanedioic acid是调控能量代谢的关键性膜蛋白，可将柠檬酸、琥珀酸等物质转运到胞内参与能量的合成[8]，而“益气通窍饮”通过加强体内的能量代谢，为免疫细胞的增殖、复制提供能量进而减轻炎症反应。
SM、PE的代谢水平相较于空白组，出现了降低，但SM在代谢过程中会生成神经酰胺（Cer），可增加活性氧自由基（ROS）促进炎症反应[9]；
Cer经过分解生成PE的过程中产生的鞘氨醇，也可促进炎症[10]，故笔者分析可能是由于慢性炎症过程中，ROS的累积会攻击细胞膜脂质,破坏了鞘磷脂结构的完整性[11]，进而导致检测出的代谢水平减低。
PC、LysoPC、LysoPE，PS为甘油磷脂相关的代谢产物，代谢水平整体呈下降趋势，同样Arachidic acid作为广泛存在于磷脂中的不饱和脂肪酸，与其代谢产物20-Hydroxyeicosatetraenoic acid的水平也出现降低。但是在治疗组中，虽然PC的代谢前体PS出现了降低，但PC的代谢水平却出现了两种趋势，含有饱和碳链的磷脂酰胆碱（PC(18:2(9Z,12Z)/16:0）、PC（16:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)）出现升高趋势，含有不饱和碳链的磷脂酰胆碱（PC(P-18:1(11Z)/18:3(9Z,12Z,15Z))）出现了下调趋势。由于含胆碱脂质的相对不稳定性和复杂性，故推测碳链与慢性鼻-鼻窦炎之间存在潜在联系。而经治疗后，代谢水平的回调推测“益气通窍饮”可以纠正脂质代谢紊乱，以增加抗炎介质释放。
本研究首次通过代谢组学表征了肺脾气虚型CRsNP的内源性代谢物组的差异情况，表明“益气通窍饮”通过多种代谢途径对鼻腔黏膜炎症进行调节。
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