陈聪，李俊，温林凤，徐婷，张慧婷，钟梦丽，林银山，曹庸*，符姜燕*，刘占*
（1.中炬高新技术实业（集团）股份有限公司，广东中山 528400）（2.华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室，广东省天然活性物工程技术研究中心，广东广州 510642）(3.广东美味鲜调味食品有限公司，广东中山 528400)
广式酱油属于高盐稀态酱油，是中国传统酿造酱油的一个重要流派，形成于以广东为主的华南地区[1]。该类酱油以全大豆和面粉为主要原料，经3个月以上的日晒夜露天然酿造而成。酱油发酵经过多种微生物共同作用形成了其独特的香味，每种微生物在酱油酿造过程中不同时段的具体作用很难确切描述，尤其是采用常温高盐稀态发酵工艺，周期长，受自然环境影响较大，使得微生物之间的相互作用更加复杂。在酱油发酵过程中，微生物的种群结构及相互作用对酱油色、香、味和体态的形成及品质起到了关键的作用[2,3]。
运用宏基因组、宏转录和组宏蛋白组等分子生物技术，可对环境中89%~99%不可培养或未培养微生物的检测[4]。宏蛋白质组学是研究特定环境下各种微生物蛋白质种类和差异表达情况的重要技术方法[5]，使得人们可以更系统深入地研究发酵食品微生物群落结构及其功能。Xie等[6]采用宏组学方法研究了传统大酱与商业大酱微生物分类学、功能特征和代谢模式的差异，强调了传统发酵大酱的食品安全风险。为了揭示微生物的耐盐机制，Li等[7]从日本豆酱中筛选出菌株Lb.plantarumFS5-5，使用 GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）对差异分泌蛋白进行功能分析，揭示了微生物耐盐回应性的分子机制。Zheng等[8]利用宏蛋白组学方法，比较了中国 30~300年浓香型白酒的窖泥中微生物蛋白的差异表达情况，证实产甲烷细菌，如梭菌和甲烷细菌，与一些风味物质如丁酸、己酸和乙酸的形成高度相关，从而生产优质白酒。
蛋白质组学样本的制备是宏蛋白组学实验的关键步骤，适宜的蛋白样本制备技术可以获得更为丰富和客观的宏蛋白组学信息[9]。从发酵食品提取蛋白质存在一定的挑战，这是因为发酵食品中含有多种微生物，它们具有不同的细胞壁结构和不同水平的细胞裂解抗性[10]；
同时，复杂的发酵环境也在不同程度上对蛋白的提取造成影响，比如酱油的高盐环境[11]，食醋中的高酸性环境[12]，发酵谷物中的高酒精环境[13]。发酵食品中没有统一的蛋白质提取方法，目前主要针对高盐稀态酱油的优势菌米曲霉菌的蛋白组学研究较多，鲜有高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学的研究[14,15]。本研究通过比较不同的酱油微生物蛋白提取和纯化方法，探索一种适用于广式酱油发酵过程中微生物蛋白组学研究的样本制备方法，以进一步揭开广式酱油微生物群落的神秘面纱。
1.1 主要实验材料与试剂
酱油，广东美味鲜调味食品有限公司；
细菌蛋白提取试剂盒，贝博公司；
TCA蛋白浓缩试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；
BCA试剂盒，美国Thermo公司；
乙醇、乙腈、甲酸（质谱纯），美国J.T.Baker公司。
1.2 实验设备
LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱仪、分析柱：C18分析柱（50 μm×2 μm×15 cm），美国Thermo公司；
Waters 2695色谱仪，美国Waters公司；
多功能酶标仪，美国珀金埃尔默仪器有限公司；
LC-10 A高效液相色谱仪，日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酱油样品蛋白的提取
取高盐稀态酱油发酵周期的酱醪50 g，水黄50 mL，充分混匀，纱布过滤，取滤液，3 000×g，4 ℃，离心5 min，弃上清，得到菌沉淀，并用无菌水清洗2次。
根据贝博公司的细菌提取试剂盒方法改良，加入等体积蛋白提取液，珠磨仪-20 ℃研磨3 min，每研磨30 s，间隔20 s。冰上放置1 h，每间隔10 min混匀1次。冰上超声5 min，20 000×g，4 ℃，离心15 min，将上清转移至预冷的新的1 mL离心管，得到酱油样品的蛋白提取液。
1.3.2 酱油样品蛋白的纯化
方法一：TCA浓缩除杂，根据TCA蛋白浓缩试剂盒法改良，取200 µg酱油样品蛋白提取液，加入1/4体积沉淀剂A，混匀，冰上静置1 h，14 000 r/min，4 ℃，离心10 min，弃上清，加入600 µL洗涤液B，混匀，冰上静置10 min，14 000 r/min，4 ℃，离心10 min，弃上清，重复洗涤1次，用蛋白提取液溶解沉淀。
方法二：超滤管除杂，取200 µg酱油样品蛋白提取液转移至超滤管（10 ku），加φ=50%乙醇500 µL，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃滤液，重复清洗三次，用蛋白提取液溶解截流于滤膜的蛋白，转移至新的离心管。
1.3.3 酱油样品蛋白的定量
采用BCA法[16]，测定蛋白含量。标准曲线见图1。
图1 BCA蛋白质浓度标准曲线Fig.1 BCA protein concentration standard curve
1.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳
取 20 µg蛋白样品与 5 µL缓冲液（0.2 mol/L Tris-HCl，m=2% SDS，φ=10%甘油，m=0.02%溴酚蓝）混合，在SDS-PAGE凝胶（m=12.5%分离胶，m=4%浓缩胶）中垂直电泳（浓缩胶15 mA恒定电流，分离胶60 mA恒定电流），然后用考马斯蓝染色G-250对SDS-PAGE凝胶进行染色。
1.3.5 烷基化和酶切
取100 µg蛋白样品加入超滤管中，加入终浓度为50 mmol/L的DTT，60 ℃，保温40 min，冷却至室温，加入50 mmol/L的IAM，避光反应40 min，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，弃滤液。
超滤管中加入 100 µL 25 mmol/L NH4HCO3，按蛋白:酶=1:50，加入胰蛋白酶，酶切15 h。12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，取滤液，为制备好的多肽样品。
1.3.6 LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱检测
分离样品采用LC-ESI-MS/MS分析，使用Waters 2695 nanoLC-LTQ Orbitrap Velos Pro ETD系统进行分析。色谱梯度从5%逐步升高40%，流动相A为0.1%（V/V）FA；
流动相B为ACN。LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱条件为：阳离子模式，ESI电喷雾离子源，喷雾电压2.0 kV，CID碰撞模式，在350~1 800m/z范围内扫描，采集时间为120 min。
1.3.7 数据处理
LTQ Orbitrap Velos Pro ETD所得原始质谱数据使用Proteome Discoverer 2.5软件进行蛋白肽段匹配和数据库搜索鉴定。搜库参数设置为：胰蛋白酶切，最多漏切位点数为2，母离子质量偏差在10-5以内，质量偏差为0.6 u，FDR假阳性率＜0.01。
2.1 酱油发酵过程中微生物蛋白的提取
广式酱油发酵的原料为大豆，经蒸煮后面粉、曲霉混合制曲，并与盐水混合，自然发酵，发酵过程中酱醪与盐水会分层。将微生物与大豆、小麦等植物蛋白分离，在高盐和复杂发酵产物的环境下获得高质量的微生物蛋白，是进行酱油发酵过程微生物蛋白质组学分析的前提条件。本研究将发酵前期（0 d）、中期（60 d）和后期（120 d）的酱醪和盐水，混合均匀，分别取25 g酱醪与25 mL盐水混合成一个样品，另取50 mL盐水作为一个样品，经纱布过滤，滤液离心，所得沉淀在低温下经球磨仪研磨后用细菌提取试剂盒提取，根据 BCA法测定含量。本实验人工培养的大肠杆菌（OD值0.6），作为阳性对照，在相同条件下提取并测定其蛋白含量。
酱醪和盐水的混合物，其蛋白含量为0.70 mg/100 g，是盐水中的蛋白（0.18 mg/100 g）的388.89%，但是只有大肠杆菌的蛋白含量（1.24 mg/100 g）的56.45%，如表1所示。说明酱醪中含有大量的微生物，可通过盐水和酱醪的混合搅拌，经纱布过滤，将大豆等杂质分离，获得比盐水中更多的微生物，同时，经纱布过滤、离心所得沉淀除了菌沉淀，还有酱油发酵过程中微生物代谢产生的各种杂质，从而影响其蛋白提取效率，且可能会带入其他杂质，所得蛋白初提物需要进行分离纯化。
表1 BCA蛋白含量测定结果Table 1 BCA protein content determination resµLts
2.2 蛋白纯化及检测
根据蛋白质的胶体性质和分子大小，分别用 TCA浓缩法（方法一）和超滤管法（方法二）纯化酱油微生物蛋白初提液，并用 SDS-PAGE凝胶电泳法检测其纯度，结果如图2所示。利用Image J软件对凝胶图进行分析，发现采用TCA浓缩法可鉴定到26个条带，比超滤法鉴定到的13个蛋白条带更丰富、更清晰，在相同上样量的条件下，通过灰度值比较，两种方法的灰度值分别为47 762.68和17 243.47，说明TCA浓缩法可得到更多更纯的蛋白。超滤法纯化虽然操作简便，但是纯化效果较差，其原因可能是因为在蛋白初提液中含有脂类、烷烃类等大分子[17]，无法通过超滤管的滤膜。
图2 不同纯化方法制备的酱油微生物蛋白SDS-PAGE凝胶图Fig.2 SDS-PAGE gel diagram of soy microbial protein purified by different methods
2.3 酶切及LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱检测
图3 不同纯化方法制备的酱油微生物多肽的一级质谱图Fig.3 MS1 mass spectrometry of microbial peptides from soy sauce prepared by different purification methods
方法一和方法二纯化后的酱油微生物蛋白，经烷基化和胰蛋白酶酶切后，通过LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱检测其酶切效果。TCA浓缩法（方法一）和超滤法（方法二）所得蛋白酶切后，其nanoLC-MS/MS一级质谱图的峰强分别为5.56×107和3.34×107，通过Proteome Discoverer 2.5软件分析可鉴定到的多肽数量分别是2 495和1 682，说明TCA浓缩法所得蛋白酶切更充分，多肽强度和鉴定率更高，而超滤法虽然操作更简便，但是其纯化后的蛋白可能含有大豆降解及微生物发酵产生的酚类物质，对胰蛋白酶的活性有影响[18]，酶切后多肽强度和鉴定率较低，说明其蛋白未酶切充分，会减少MS/MS的多肽鉴定率，且其本身含有的大分子杂质可能会造成nanoLC分析柱的堵塞，进而提高了MS/MS质谱鉴定的成本。
2.4 不同发酵时间的酱油微生物多肽样品的MS/MS质谱分析及蛋白鉴定
选取酱油发酵前期（0 d）、中期（60 d）和后期（120 d）的样品经上述优化后的方法制备多肽样品，通过Waters 2695 nanoLC液相和LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱仪联用，进行多肽质谱的鉴定，其总离子流图如图4所示，结果显示高盐稀态酱油在不同发酵时间的微生物经过上述优化方法所得多肽，其总离子流图均呈正态分布，信噪比高，图谱信息丰富。
图4 不同发酵时间的酱油微生物多肽样品的MS/MS总离子质谱图Fig.4 MS/MS total ion mass spectrometry of soy sauce microbial peptides at different fermentation times
利用Proteome Discoverer 2.5鉴定到的质谱图通过Proteome Discoverer 2.5分析样品酶切效果（图5），发现84.45%的肽段完全酶切，仅有15.55%的遗漏酶切位点（14.52%的单位点遗漏酶漏切和1.03%的双位点遗漏酶漏切），比李倩等[19]报导的胰蛋白酶遗漏酶切位点的比例（约27%）要低，说明酶切充分，样品制备质量好。
图5 胰蛋白酶遗漏酶切位点数目统计Fig.5 Statisticanalysis of no missed cleavage sites and missed cleavage sites in trypsin digestion
图6 广式酱油不同发酵时间微生物蛋白质谱鉴定的韦恩图Fig.6 Venn diagram of microbial protein spectrum identification of Cantonese soy sauce at different fermentation time
对所有质谱鉴定到图谱进行蛋白肽段匹配，并和本批次的高盐稀态酱油宏基因组鉴定到前 15种优势菌群数据库搜索，共鉴定到不同酱油发酵时间的微生物蛋白数量分别为：0 d，1 035种；
60 d，1 104种；
120 d，1 046种，在三个时期鉴定到的共同蛋白为824种。说明该方法对不用发酵时期的酱油样品均可获得稳定且丰富的微生物蛋白鉴定数。与SDS-PAGE法相比较，如Zhang[20]和乌日娜等[21]采用SDS-PAGE分离纯化蛋白的方法分别鉴定到441个大酱蛋白和232个豆酱蛋白，本研究采用TCA浓缩法制备的蛋白样品，利用nanoLC- LTQ Orbitrap Velos Pro ETD质谱检测，可鉴定到更多的蛋白。
广式酱油发酵周期长，微生物种群结构复杂，通过对发酵过程中微生物蛋白组的研究，可以深入地分析其组成、变化规律及对酱油风味物质的贡献与影响。在发酵酱油高盐和复杂代谢产物的环境下，制备高质量的微生物蛋白，是研究其微生物蛋白质组学规律的前提和关键。本研究从以下三个方面对广式酱油微生物蛋白组学分析的样品制备方法进行了优化：第一，通过等比例混合酱醪和盐水、纱布过滤的前处理方式，洗脱原曲上的微生物，去除大量大豆和小麦等原料蛋白。第二，结合细菌提取试剂盒和TCA浓缩试剂盒，提取纯化蛋白，其SDS-PAGE凝胶图谱比使用超滤法纯化的蛋白，条带更丰富，蛋白纯度更高。第三，利用超滤管的分子筛作用，快速除盐除杂，减少了酱油中的高盐和有机质对后续胰蛋白酶酶切效果的影响。使用上述方法，制备广式酱油发酵早期（0 d）、中期（60 d）和晚期（120 d）的微生物蛋白样品，经LTQ Orbitrap质谱检测，分别鉴定到1 035，1 104和1 046种蛋白，验证了该方法的稳定性和适用广泛性。总之，此方法操作简单，实验速度快，所鉴定到的微生物蛋白丰富，为进一步从蛋白组学研究广式酱油发酵过程中微生物的功能本质及复杂的底物-微生物群系相互作用机制提供更丰富的生物信息，同时也为研究其他发酵食品在复杂环境下的微生物蛋白组学内容提供了一种样本制备方法的参考。
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