张 恺黄鈺婷宇文欢莎廖嘉宝*樊官伟*
（1.天津中医药大学第一附属医院，国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193；
2.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；
3.天津市中医方证转化研究重点实验室，天津 300193；
4.天津中医药大学中医药研究院，天津 301617）
独一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo 为我国藏族民间传统药材，应用历史悠久，具有活血止血、祛风止痛功效，临床上用于治疗跌打损伤、外伤出血、风湿痹痛等［1-2］。目前独一味单味制剂共有两种剂型收录于2020 年版《中国药典》，分别为胶囊剂与片剂。运用现代制药工艺技术将独一味药材进一步提取加工制成配方颗粒，是独一味制剂现代化剂型改革的一次有益尝试。配方颗粒相较于传统剂型具有调配灵活、随证加减、剂量准确、服用方便等优势，但其疗效确切与否目前仍有部分争议，一定程度上制约了其临床应用与市场推广［3-4］。因此，中药配方颗粒的有效性评价是当前研究的重点。针对独一味配方颗粒的药效学评价，目前尚缺乏相关研究报道。本研究以独一味配方颗粒为研究对象，分别以醋酸诱导的小鼠扭体疼痛模型、福尔马林致痛小鼠模型以及佐剂性关节炎大鼠模型，对独一味配方颗粒的镇痛、抗炎、止血药效进行综合评价，以期为其临床应用提供科学依据。
1.1 仪器 YLS-7C 足趾容积测量仪（济南益延科技发展有限公司）；
NX-102 动物即时凝血分析仪（广州万孚生物技术股份有限公司）；
Varioskan Lux 多功能微孔板读数仪、Legend Micro 21R 冷冻高速离心机、MaxQ 4450 小型台式恒温摇床（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；
GENIUS 3 涡旋混合器（德国IKA 公司）；
NewClassic MF 电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；
Milli-Q Integral 5 超纯水系统（美国Millipore 公司）。
1.2 动物 SPF 级雄性ICR 小鼠，体质量18～22 g；
SPF级雄性SD 大鼠，体质量180～200 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006。实验动物饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK（津）2019-0002。实验动物操作均遵从中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会审定的规范要求。
1.3 药物与试剂 独一味配方颗粒由华润三九医药股份有限公司提供（批号2004001Y），每1 g 独一味配方颗粒相当于4 g 饮片；
独一味胶囊购自康县独一味生物制药有限公司（批号1911026305）。布洛芬片（0.1 g／片）购自特一药业集团股份有限公司（批号32191204）；
云南白药（4.0 g／瓶）购自云南白药集团股份有限公司（批号ZHA1914）。实验时取布洛芬片研磨成细粉（或取云南白药细粉），加入蒸馏水与0.5%羧甲基纤维素钠，配制成所需浓度的混悬液。冰醋酸（天津市风船化学试剂科技有限公司，批号202005262）；
福尔马林溶液（北京索莱宝科技有限公司，批号20191213）；
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（美国Sigma-Aldrich 公司，批号SLCF1289、SLBW2506）。大鼠白细胞介素1β（IL-1β）（批号KE20005）、大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 检测试剂盒（批号KE20001）购自美国Proteintech Group 公司；
大鼠白细胞介素6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（批号011020200529）购自上海碧云天生物技术研究所；
大鼠α 颗粒膜糖蛋白（GMP-140）（批号CSB-E07399r）、大鼠凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）ELISA 检测试剂盒（批号CSB-E08432r）购自武汉华美生物工程有限公司。
2.1 分组与造模
2.1.1 醋酸致小鼠扭体模型 将48 只ICR 小鼠随机分为空白组，模型组，独一味配方颗粒低、高剂量组，独一味胶囊组，阳性药组，每组8 只。配方颗粒低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.059、0.29 g／kg 独一味配方颗粒水溶液；
胶囊组灌胃给予0.35 g／kg 胶囊内容物水溶液；
阳性药组灌胃给予0.078 g／kg 布洛芬混悬液；
空白组与模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1 次，连续给药5 d。于给药第5 天，末次给药1 h后，模型组与各给药组小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.02 mL／g，诱发小鼠扭体反应，空白组注射等量生理盐水。记录各组小鼠初次发生扭体反应（腹部收缩内凹，躯干与后肢伸展，臀部与一侧肢体内旋）的时间，以及20 min 内小鼠发生扭体反应的次数。
2.1.2 福尔马林致痛小鼠模型 小鼠按“2.1.1” 项下分组、给药。于给药第5 天，末次给药1 h 后，模型组与各给药组小鼠左后足跖皮下注射5%福尔马林50 μL，诱发小鼠舔足反应，生理盐水组注射等量生理盐水。皮下注射后，立即将小鼠放入烧杯内并计时，分别记录第Ⅰ时相神经疼痛期（0～5 min）和第Ⅱ时相炎性疼痛期（15～30 min）小鼠舔（抓咬）左后足的累计时间，计算小鼠舔足反应的抑制率。
2.1.3 佐剂性关节炎大鼠模型 将48 只SD 大鼠随机分为空白组，模型组，独一味配方颗粒低、高剂量组，独一味胶囊组，阳性药组，每组8 只。造模第1 天，于大鼠左后足跖与尾根部皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL，并于造模第11 天在相同部位皮内注射不完全弗氏佐剂0.1 mL 加强免疫。于造模第18 天开始灌胃给药，配方颗粒低、高剂量组大鼠分别灌胃给予0.041、0.20 g／kg 独一味配方颗粒水溶液；
胶囊组灌胃给予0.24 g／kg 胶囊内容物水溶液；
阳性药组灌胃给予0.054 g／kg 布洛芬混悬液；
空白组与模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1 次，连续给药7 d。
2.2 足跖肿胀度检测 分别于造模前、造模第17 天及给药第7 天，采用足跖容积测量仪测量大鼠左后足跖及无毛区以下的足跖容积，计算给药后大鼠足跖肿胀率。
2.3 炎症因子检测 于给药第7 天，足跖肿胀度检测结束2 h 后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉，腹主动脉采血，室温放置2 h 后3 500 r／min 低温离心10 min，分离上层血清，采用ELISA 法检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。
2.4 断尾出血时间检测 大鼠于末次灌胃给药1 h 后，固定于固定器，尾部清洗消毒后，距尾尖部10 mm 处横断，每隔30 s 用滤纸片吸去血滴1 次，直至出血自然停止，记录自断尾起至用滤纸吸至无血时的时间。
2.5 血液凝集参数检测 出血时间测定1.5 h 后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉，腹主动脉采血，加入枸橼酸钠抗凝管，采用凝血分析仪测定大鼠血浆的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB）。
2.6 血小板活化标志物检测 取枸橼酸抗凝全血，3 500 r／min 低温离心10 min，分离上层血浆，ELISA 法检测血浆GMP-140、TAT 水平。
2.7 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，统计前对样本数据进行正态分布与方差齐性检验，偏态分布数据采用Mann-Whitney U 检验分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
3.1 扭体反应观察 与模型组比较，独一味配方颗粒高剂量组、胶囊组与阳性药组小鼠扭体次数均减少（P＜0.05，P＜0.01），阳性药组小鼠初次扭体时间延长（P＜0.05），见表1。
表1 独一味对醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s， n＝8）
表1 独一味对醋酸致小鼠扭体反应的影响（±s， n＝8）
注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.2 舔足反应观察 由表2 可知，与空白组比较，模型组小鼠在第Ⅰ、Ⅱ时相中的舔足反应累计时间均延长（P＜0.01），表明动物模型成功建立；
与模型组比较，独一味配方颗粒高剂量组、胶囊组、阳性药组小鼠Ⅱ相舔足反应累计时间均减少（P＜0.05）。高剂量独一味配方颗粒与独一味胶囊对福尔马林诱导的小鼠Ⅱ相舔足反应抑制率分别为30.91%、32.17%，高于Ⅰ相抑制率，提示对福尔马林诱导的Ⅱ相炎性疼痛具有抑制作用，但对Ⅰ相神经疼痛的干预作用有限。
表2 独一味对福尔马林诱导的小鼠疼痛模型的影响（±s， n＝8）
表2 独一味对福尔马林诱导的小鼠疼痛模型的影响（±s， n＝8）
注：与空白组比较，＃＃P＜0.01；
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.3 佐剂性关节炎大鼠足跖肿胀度 造模后各组大鼠足跖与踝关节肿胀明显，呈进行性加重。与空白组比较，各组大鼠足跖容积均增大（P＜0.01）；
与模型组比较，独一味配方颗粒高剂量组、胶囊组与阳性药组大鼠足跖容积均缩小（P＜0.05），大鼠足跖肿胀率降低（P＜0.05），提示独一味配方颗粒可减轻佐剂性关节炎大鼠的足跖肿胀度，改善关节炎症状，见表3。
表3 独一味对佐剂性关节炎大鼠足跖肿胀的影响（±s， n＝8）
表3 独一味对佐剂性关节炎大鼠足跖肿胀的影响（±s， n＝8）
注：与造模第17 天空白组比较，＃＃P＜0.01；
与给药第7 天空白组比较，††P＜0.01；
与给药第7 天模型组比较，*P＜0.05。
3.4 佐剂性关节炎大鼠炎症因子 由图1 可知，与空白组比较，佐剂性关节炎大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高（P＜0.01）；
与模型组比较，阳性药组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），独一味配方颗粒高剂量组与胶囊组大鼠血清IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。
图1 独一味对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）水平的影响（±s， n＝8）
3.5 大鼠断尾出血时间 由表4 可知，高、低剂量独一味配方颗粒均能缩短正常大鼠的断尾出血时间（P＜0.05），提示独一味配方颗粒可发挥一定的止血功效。
表4 独一味对大鼠出血时间的影响（±s， n＝8）
表4 独一味对大鼠出血时间的影响（±s， n＝8）
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.6 血液凝集参数 凝血四项检测结果见表5，独一味配方颗粒、独一味胶囊、云南白药对大鼠PT、TT、APTT 均无显著影响（P＞0.05）。与空白组比较，各给药组大鼠FIB值均增加（P＜0.05，P＜0.01）。
表5 独一味对大鼠血液凝集参数的影响（±s， n＝8）
表5 独一味对大鼠血液凝集参数的影响（±s， n＝8）
注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.7 血小板活化标志物测定 由图2 可知，与空白组比较，独一味配方颗粒高剂量组、胶囊组、云南白药组大鼠血浆GMP-140 与TAT 水平均上调（P＜0.05，P＜0.01），提示促进血小板活化可能是独一味配方颗粒发挥止血作用的机制。
图2 独一味对大鼠血浆GMP-140（A）、TAT（B）水平的影响（±s， n＝8）
本研究选用2 种经典的疼痛动物模型探讨独一味配方颗粒的镇痛作用。其中，醋酸诱导的小鼠扭体疼痛模型以低浓度的醋酸作为化学性致炎因子，通过腹腔注射使小鼠产生剧烈疼痛而出现扭体反应，是一种非选择性外周疼痛模型［5］。结果显示独一味配方颗粒可减少醋酸诱导的小鼠扭体反应次数，表明独一味配方颗粒对急性疼痛可发挥一定的镇痛效应。另一方面，福尔马林致痛模型表现出明显的两相疼痛反应，Ⅰ相（0～5 min）反应为刺激中枢神经末梢所致，由福尔马林的化学刺激以及注射器的物理刺激引起；
Ⅱ相（15～30 min）反应则由内源性炎症因子引起，为相关炎症介质增多所致［6］。模型组小鼠经福尔马林皮下注射诱导出现频繁且持续的舔足反应［7］。独一味配方颗粒抑制模型小鼠的Ⅱ相疼痛反应，缩短舔足反应累计时间，增加舔足反应抑制率，证明独一味配方颗粒具有镇痛作用，尤其对炎性介质参与的疼痛表现出较好的镇痛药效。
为了进一步探讨独一味配方颗粒的抗炎药效，建立佐剂诱导的关节炎大鼠模型，结果表明高剂量独一味配方颗粒可减轻关节炎大鼠的足跖肿胀度，降低大鼠足跖肿胀率，缓解关节炎症状。IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子是滑膜炎症及关节损伤的重要介质［8-9］，在类风湿关节炎的发生发展中发挥关键作用［10］。佐剂性关节炎大鼠模型血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均升高；
独一味配方颗粒给药后，大鼠血清IL-6、TNF-α 水平均下调，提示独一味配方颗粒可抑制血清炎性因子表达，发挥一定的抗炎药效。环烯醚萜苷类化合物为独一味的主要抗炎活性成分［11］，其可通过抑制环氧合酶活性，减少前列腺素的合成而发挥抗炎活性［12］。其中，8-乙酰氧基山栀苷甲酯与8-去羟基山栀子苷为代表性化学成分，具有较强的抗炎作用［5］。8-乙酰氧基山栀苷甲酯可通过抑制TNF-α 介导的NF-κB 活化，减少炎症相关细胞因子的合成释放而发挥抗炎作用［13］，这可能是独一味制剂发挥抗炎作用的重要分子机制。
在止血药效方面，独一味配方颗粒可缩短正常大鼠的断尾出血时间。PT 主要反映外源性凝血系统功能；
APTT可反映内源性凝血系统功能；
TT 反映凝血共同途径状态；
FIB 则为凝血酶作用的底物［14］。独一味配方颗粒可升高大鼠血液FIB 水平，但对PT、TT、APTT 无显著影响，提示独一味配方颗粒可能通过增加纤维蛋白原水平，影响凝血-纤溶系统而发挥止血功效。另外，独一味配方颗粒可上调大鼠血浆GMP-140 与TAT 水平。GMP-140 存在于血小板α颗粒内，是反映血小板活化程度的特异性指标［15］。TAT 则是体内凝血和抗凝血相互作用的产物，是凝血酶生成的标志物之一［16］。以上结果提示独一味配方颗粒的止血机制可能与升高大鼠血液FIB 水平，上调血浆GMP-140 与TAT 水平相关。
综上所述，独一味配方颗粒可抑制醋酸与福尔马林诱导的小鼠疼痛反应，减轻佐剂性关节炎大鼠的足跖肿胀度，下调大鼠血清IL-6 与TNF-α 水平，并可缩短正常大鼠的断尾出血时间，调节大鼠血液FIB 与血浆GMP-140、TAT 水平，其中高剂量配方颗粒的镇痛、抗炎、止血药效与独一味胶囊等效。该研究为独一味配方颗粒的临床应用提供了一定的药效学依据。
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