肖鹏 肖宏 金海
(1遵义市红花岗区人民医院消化内科，贵州 遵义 563000；
遵义医科大学 2第二附属医院消化内科；
3附属医院消化病医院 附属医院消化内科)
十二指肠溃疡(DU)是临床常见的消化系统疾病，与幽门螺杆菌(HP)感染、药物损伤、精神心理因素、不良饮食习惯、自身免疫等因素密切相关〔1〕。其发生机制主要是由于十二指肠黏膜损伤因素和保护因素失衡引起。十二指肠黏膜碳酸氢盐转运蛋白分泌的碳酸氢盐是抵抗胃酸、胃蛋白酶损害的主要防御机制〔2〕。因此增加十二指肠溃疡患者的碳酸氢盐转运蛋白分泌有助于十二指肠溃疡的愈合。茶多酚是一种天然的生物制剂，研究显示，茶多酚在创面损伤、口腔溃疡、溃疡性结肠炎等疾病中具有一定作用〔3〕。本研究探讨茶多酚对十二指肠黏膜碳酸氢盐转运蛋白的作用。
1.1研究对象 人十二指肠黏膜组织均取自2020年1月至2020年6月就诊于遵义市红花岗人民医院内镜中心的患者。患者均签署知情同意书。SD大鼠：40只8～12周龄SD大鼠，体重180～220 g，均购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养于贵州省消化疾病研究所动物室。
1.2主要药物及试剂 茶多酚购于成都瑞芬思公司；
半胱胺盐酸盐(C106201-100 g，阿拉丁公司)；
Anti-离子交换体(SLC)26A3抗体(ab83545)，Anti-囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)抗体(ab2784)购于Abcam公司；
兔二抗(HS101-01)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(DQ111-01)、电化学发光(ECL)剂(DW101-01)、actin内参抗体(HC201-02)、逆转录试剂盒(AE311-03)、聚合酶链反应(PCR)扩增酶(AQ601-02)均购于全式金生物科技有限公司。
1.3动物造模及给药 将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组(茶多酚100 mg/kg)及高剂量组(茶多酚300 mg/kg)各10只。所有大鼠禁食不禁水24 h后，模型组及低、高剂量组于大鼠经颈背后皮下松弛处皮下注射10%盐酸半胱胺(300 mg/kg)，对照组采用同样操作，在颈背后注射同等剂量生理盐水，自由饮食。造模24 h后，为了保持溃疡的慢性过程，此后给模型组和低、高剂量组大鼠饮用1% 的半胱胺水来替代饮用水，对照组饮水正常；
造模后48 h开始，连续以灌胃法给予低、高剂量组茶多酚，对照组和模型组给予同等剂量生理盐水；
观察大鼠的精神活动、饮食饮水等情况，连续给药4 w后处死大鼠，观察大鼠十二指肠溃疡的肉眼观及苏木素-伊红(HE)染色情况，评判治疗效果。收集大鼠十二指肠组织，用RT-PCR，Western印迹检测组织中碳酸氢盐转运蛋白CFTR及SLC26A3的含量。
1.4十二指肠黏膜组织HE染色及SLC26A3和CFTR测定 HE染色：将固定好的十二指肠组织脱水、包埋、切片，80℃烤箱烤片20 min，过二甲苯2×15 min，自然水洗后，苏木素染色1 min，过1%盐酸乙醇进行分化，自来水冲洗返蓝，伊红染色1 min，过梯度酒精后，过二甲苯2×15 min，封片、晾干、观察。Western印迹：提取蛋白，测定浓度后，加入上样缓冲液进行煮沸后上样，进行电泳、电转；
转膜后采用含5%脱脂牛奶TBST进行封闭，室温封闭2 h；
加入1抗4℃过夜，用TBST清洗3次×10 min；
加入2抗，室温孵育1 h，用TBST清洗3次×10 min；
加入ECL液后进行曝光，采用Graphpad软件进行分析。免疫组化染色：将固定好的十二指肠组织脱水、包埋、切片，80℃烤箱烤片20 min，过二甲苯2×15 min，过梯度酒精进行水化，采用枸橼酸盐进行抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次×5 min，采用3%H2O2封闭内源性过氧化氢酶，PBS清洗3次×5 min，封闭内源性抗原，滴加一抗过夜，PBS清洗3次×5 min，二抗室温孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素染核，过梯度酒精，封片。
1.5统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。
2.1十二指肠溃疡患者CFTR、SLC26A3表达 正常组织十二指肠黏膜上皮黏膜完整，无水肿，仅少量炎症细胞浸润，而溃疡组十二指肠黏膜上皮连续性破坏，有大量炎症细胞浸润，腺体水肿。免疫组化显示，正常黏膜上皮均表达CFTR和SLC26A3，而十二指肠溃疡组织十二指肠黏膜上皮表达量明显下降。见图1。与正常组织比较，十二指肠溃疡组织CFTR、SLC26A3蛋白和mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。图2、表1。
图1 人十二指肠黏膜上皮HE染色及CFTR、SLC26A3免疫组化染色(×200)
图2 正常组织和十二指肠溃疡组织CFTR和SLC26A3蛋白表达
2.2茶多酚对大鼠体重及进食情况的影响 在造模前各组体重及进食量之间无显著差异(P>0.05)。造模后，大鼠体重增长较对照组明显慢，进食量较对照组明显减少(P<0.05)。给予茶多酚灌胃后，高剂量组体重及进食量与模型组差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3茶多酚治疗DU大鼠十二指肠黏膜CFTR、SLC26A3免疫组化 与对照组相比，模型组十二指肠黏膜上皮CFTR和SLC26A3表达减少，服药后，低剂量组和高剂量组CFTR和SLC26A3表达均增加，高剂量组表达增加明显。见图3。
2.4茶多酚治疗UC大鼠十二指肠黏膜的形态学观察 对照组十二指肠黏膜形态完整，黏膜上皮细胞排列紧密，炎症细胞浸润少见。模型组十二指肠绒毛损伤严重，固有层分布疏散，黏膜上皮大面积脱落，中央乳糜管消失，固有层及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润。给予茶多酚治疗后，黏膜较模型组大鼠黏膜好转，固有层排列尚整齐，上皮损伤和脱落减少，炎症细胞浸润减少。见图3。
2.5茶多酚治疗DU大鼠十二指肠黏膜CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA 表达 与对照组相比，模型组十二指肠黏膜上皮CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA表达减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。服药后，低剂量组和高剂量组CFTR和SLC26A3表达均增加，高剂量组CFTR和SLC26A3的蛋白和mRNA表达增加明显，较模型组差异显著(P<0.05)。见图4、表3。
表1 正常组织和十二指肠溃疡组织CFTR、SLC26A3蛋白和mRNA表达
表2 茶多酚对十二指肠溃疡大鼠体重变化及进食量的影响
图3 茶多酚治疗DU大鼠十二指肠黏膜HE染色和CFTR、SLC26A3免疫组化染色(×200)
图4 茶多酚治疗DU大鼠十二指肠黏膜CFTR和SLC26A3蛋白表达
表3 茶多酚治疗DU大鼠十二指肠黏膜CFTR和SLC26A3蛋白和mRNA 表达
目前中医药及生物制剂在消化性溃疡的临床研究及实验研究中显示了良好的疗效〔4〕。这些制剂在消化性溃疡的治疗作用主要通过减弱损伤性因子和加强防御性因子实现的〔5〕。其疗效及作用机制在胃溃疡中的研究较多，而对十二指肠溃疡治疗疗效及其作用机制尚缺乏。
研究发现，十二指肠溃疡的发生除了与胃酸和胃蛋白酶的侵袭作用加强，也与十二指肠黏膜碳酸氢盐的分泌减少〔6〕。碳酸氢盐分泌的除了受神经体液、激素、胃酸、胆汁等的影响外，还受到碳酸氢盐转运蛋白的调控。十二指肠碳酸氢盐转运蛋白主要包括CFTR和Cl-/HCO3-SLC26家族〔7，8〕。SLC26A6在胃肠道碳酸氢盐的分泌中起着重要作用。CFTR和SLC26家族在多种器官如：肝脏、胰腺、肾脏、胃肠道、心脏、肺脏等有丰度的表达，在pH值稳态维持、免疫、肿瘤的发生、生物的发育中等起着重要作用〔9〕。CTTR和SLC26受多种信号通路的调控〔10，11〕。近年来，茶多酚这一天然生物制剂在抗氧化、抗感染、抗衰老、抗菌、抗癌变及在心肌保护、溃疡性结肠炎治疗、难治性口腔溃疡治疗和心血管疾病预防中起到重要作用〔12〕。而茶多酚通过多种作用机制实现其保护作用，如通过降低或者减少氧自由基的产生、调控磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路、核因子(NF)-κB信号通路及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路等〔13，14〕。可推测茶多酚能够通过调控十二指肠碳酸氢盐转运蛋白的表达，提高碳酸氢盐的分泌，促进十二指肠溃疡的愈合。本研究结果提示，茶多酚对十二指肠溃疡的保护作用可能通过促进碳酸氢盐转运蛋白提高碳酸氢盐的分泌量实现的。
综上，十二指肠溃疡的诱因复杂，包括HP感染、非甾体类抗炎药物、自身免疫因素、饮食、生活规律差、社会心理因素等。十二指肠溃疡主要临床表现是腹痛和消化不良，严重时会引起消化道出血及穿孔。质子泵抑制剂(PPI)能够有效治疗十二指肠溃疡，但对于难治性溃疡，药物服用依存性差、PPI制剂不良反应较多的患者，可以考虑采用茶多酚这一安全有效的生物制剂。
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