王孟迪张秋梅范 蓓Alberto Carlos Pires Dias王凤忠*王 琼*
(1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193;2.西南医科大学附属中医医院中葡中医药国际合作中心,四川 泸州 646000;3.葡萄牙米尼奥大学生物系,分子和环境生物学中心,中葡药食植物资源研究中心,葡萄牙 布拉加4710-057)
帕金森病(Parkinson’s disease,PD) 是一种由遗传和环境因素相互作用引起的老年性神经退行性疾病,临床表现为动作缓慢,肌体僵硬和静止性震颤。其典型的病理特征是中脑黑质纹状体多巴胺能神经元(dopaminergic neuron,DN)的丢失,导致多巴胺(dopamine,DA)分泌减少,并产生路易小体(Lewy bodies,LB)[1]。PD好发于中老年人群,其发病机制目前尚不清楚[2],为进一步探究PD的病因及诊疗方案,需要建立能很好模拟PD患者临床和病理表现的动物模型,神经毒素模型是最经典和历史最悠久的一类PD模型,通过使用神经毒素药物诱导啮齿类动物或灵长类动物脑中黑质纹状体神经元选择性退化,产生与临床患者相似的病理和行为变化[3]。这类神经毒素可以全身给药或局部给药,取决于所用药物的类型和所涉及的种属。多年来,包括6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)、百草枯(paraquat,PQ)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、和鱼藤酮(rotenone)在内的许多药物都被成功应用于构建PD模型[4]。6-OHDA模型是史上第一个PD动物模型,也是目前应用最广泛药物模型之一[5]。6-OHDA作为DA的羟基化衍生物,可在多巴胺能神经元内运输毒素,竞争性抑制DA[6]。该模型在病理、生化方面的表现与人类PD患者相似,如黑质DA能神经元变性坏死,黑质和纹状体TH活性及DA含量降低[7]等。
为进一步明确6-OHDA模型的造模方法和特点,本文采用文献分析的方法对近20年国内外有关6-OHDA诱导大鼠PD模型的有效文献进行统计分析,对造模要素和模型鉴定方法进行归纳总结,并对近年来6-OHDA大鼠模型在抗PD中药研究中的应用情况进行收集,为PD的机制研究及抗PD中药的非临床研究提供模型参考。
1.1 6-OHDA模型在PD研究中的应用分析
使用CNKI和PubMed两大常用数据库进行文献检索。利用CNKI的中国学术文献网络总库进行文献检索。点击“高级搜索”,在主题搜索中同时,应用“并含”输入“大鼠”,时间设定为2001年1月1日至2021年7月30日,检索有关大鼠在6-OHDA方面的中文文献,用PubMed分别以“6-OHDA”和“rat”为关键词进行文献检索,检索同时段的相关的英文文献。
当文献符合以下标准时被纳入研究:(1)在正式期刊中发表的研究性文章(综述、学位论文、会议文章剔除);(2)实验中至少设计有对照组(或假手术组)和模型组;(3)所使用动物的品系、性别、体重信息描述清楚,造模要素描述完整;(4)6-OHDA被用于建立帕金森病模型;(5)使用了至少一种行为学检测,并有行为学检测结果。获得6-OHDA相关中英文文献共312条,其中中文文献162条,有效文献105条;英文150条,有效文献73条,最终得到有效文献共计178条。
1.2 模型动物及相关检测指标的分析
采用Excel软件建立数据库,对筛选后的178篇文献中的信息进行汇总。录入实验动物品系、性别、体重,造模方法、检测指标等信息,对6-OHDA所致的PD模型动物及相关测试指标进行分析,所有图形采用GraphPad Prism 6.02软件制作。
1.3 统计学方法
通过统计相关的文献数量并计算占比,文中图形由Graphpad Software提供。
2.1 6-OHDA模型实验动物的选择
经统计,6-OHDA大鼠注射模型的使用品系主要是SD和Wistar(图1A),此外还有研究使用Long Evans大鼠[8]和Simonsen大鼠[9]。关于动物性别的选择,多数研究选择了雄性动物,少数选择了雌性动物(图1B)。在造模动物的体重选择方面,大部分的研究选择了180～250 g的体重区间(49.25%)(图1C)。
图1 6-OHDA模型动物品系与性别使用情况Figure 1 Animal strain and sex usage of 6-OHDA model
6-OHDA模型的造模方法采用将药物直接注入脑区造成损伤的方式进行,没有全身吸收的过程,因此不同动物之间的差异小,可广泛用于灵长类、啮齿类动物等。虽然灵长类动物更能模拟人类疾病的症状,但费用昂贵,不利于初期药效筛选;小鼠等小型动物脑部体积较小,难以针对特定的脑区进行注射,且术后死亡率高,造模难度较大,因此最常选择的实验动物的是大鼠。与小鼠相比,大鼠脑部体积大,手术视野宽阔,术后存活率更高。有研究指出,SD大鼠和Wistar大鼠的脑部结构不完全一致,因此在选择定位坐标时需要参考以相应品系为标本编写的脑立体图谱,以提高定位的准确度[10]。
此外,有研究表明绝经后的女性PD患者的运功能动异常可通过雌激素缓解,说明雌激素对PD具有改善作用[11]。在动物性别的选择方面,雄鼠的造模成功率显著高于雌鼠,且切除双侧卵巢的雌鼠造模成功率显著高于保留卵巢的雌鼠[12]。或许是考虑到激素周期干扰的原因,大部分的研究选择了使用雄性大鼠建立PD模型。
2.2 6-OHDA模型的造模要素
6-OHDA整体给药无法透过血脑屏障,因此,只能通过脑立体定位仪注射的方式将药物注入特定的靶点。据文献报道,在黒质纹状体多巴胺系统的不同部位注射不同剂量的 6-OHDA可建立不同损伤程度和损伤类型的PD模型[13]。
2.2.1 部位
6-OHDA注射模型所选择的注射部位主要有黑质(substantia,SN),纹状体(corpus striatum,CPu),内侧前脑束(medial forebrain bundle,MFB),中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)。据文献分析,其中28.98%的研究选择了CPu注射,27.27%的研究选择了SN注射,28.98%的研究选择了MFB注射,VTA通常与其他部位复合注射,单独不作使用;在选择单侧和双侧注射的问题上,大部分研究选择了单侧注射(98.01%),单侧造模减少了手术损伤,操作更易、死亡率更低,同时可对正常侧和手术侧进行对比。在单侧注射模型中,70.86%的文献选择了单侧单点注射,23.17%的文献选择了单侧双点注射,3.97%的文献选择单侧多点(3点及以上)注射。采用双侧造模的文献仅有2.58%,因其损伤程度大,致死率高,故不做常规选择[14]。
复合注射模型常见的有SN+VTA(14,7.95%)、SN+MFB(5,2.84%)、MFB+VTA(3,1.70%)和SN+CPu(2,1.14%),见表1。
表1 6-OHDA模型的造模部位Table 1 The molding site of the 6-OHDA model
(1)黑质(substantia,SN)
SN主要的注射部位为黒质致密部(SNc),是黑质纹状体通路的起源部位,此处有丰富的DA能神经元,在该处造模可直接损毁 DN胞体,引起手术侧纹状体内DA水平降低,DA受体数量呈代偿性增加。6-OHDA注射到黑质,12 h内即开始发生DA神经元变性[15],因此是常用的注射部位。SN体积狭小,形状呈扁柱状, 难以精准定位,单点注射模型的成功率较低,双侧造模易出现吞咽困难、渴感缺乏和运动障碍,甚至死亡,通常选择单侧注射或与其他位点联合注射,如李进等[16]采用SN+VTA联合造模,以阿扑吗啡(apomorphine,APO)旋转实验作为模型鉴定标准,在4周时成功率达60%,高于单一黒质组(30%);范凯等[17]采用单侧SN+MFB联合造模,模型成功率67.7%,术后死亡率仅2.9%。
(2)内侧前脑束(Medial forebrain bundle,MFB)
MFB是一个神经传导束,起始于中脑DA能神经元,部分纤维终止于纹状体,邻近黑质纹状体DA能神经通路,该通路由位于黑质致密部(SNC)的A9细胞群组成,沿MFB 发出纤维投射到纹状体的尾壳核,6-OHDA单侧注射到MFB中可导致A9和A10细胞群的完全破坏[18]。此位点注射模型对苯丙胺和APO都有能产生旋转行为,在APO旋转实验中出现阳性的大鼠CPu中DA组织含量减少99.8%,SN中DA组织含量减少85%[18]。该模型能使DN在较短时间内快速死亡,不易模拟早期PD的病理表现,但能产生肌肉震颤行为,可模拟晚期患者的临床特征,通常用于中晚期PD模型的研究[19]。由于MFB解剖面积较小,定位相对困难,通常采用单侧多点或与其他部位联合造模,罗蔚锋等[20]采用单侧双位点注射,术后4～6周成功率达77%;秦晓凌等[21]采用单侧单点注射,术后2周成功率可达46.94%,3周成功率可达34.69%,且可维持至术后第10周。
(3)纹状体(Corpus striatum,CPu)
CPu位于黑质纹状体通路的末端,有文献报道单侧CPu注射6-OHDA,可使部分DA耗竭,CPu中DA水平降低60%～80%,适用于构建早中期PD模型[22]。与MFB注射相比,该模型导致的SNpc损伤程度不太明显,对DN是一种缓慢作用过程,将在4～6周逐渐演变。因此该模型引发的病理变化更接近临床患者DN进行性退变的过程[23],有文献指出6-OHDA直接注入SNc会造成过度的氧化应激反应,注入CPu部位可以一定程度避免[24]。CPu区域较大,注射操作的准确程度更高,目前纹状体注射6-OHDA通常采用单点、两点或多点注射法[13]。王晓晓等[25]采用单侧双靶点法分别在尾壳核内和苍白球内进行注射,2周即诱导出APO旋转行为,4周后造模成功率为88.6% ;Kirik等[13]采用单侧四点注射后模型的毁损侧纹状体TH免疫阳性纤维缺失80%～95%,而损伤侧SN部的DN缺失达75%;黄世明等[26]采用单侧CPu四点注射大鼠PD模型,术后第2周成功率为86.1%。
(4)中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)
大鼠中脑多巴胺的主要来源是腹侧被盖区(VTA)的A10细胞,它是多巴胺能中脑边缘通路的起源[27-28]。VTA处进行6- OHDA注射可以使黑质DN胞体发生逆行性变性, 还能造成纹状体DN神经末梢发生顺行性变性。有文献报道,VTA与躯体运动密切相关,在该点注射造模能增加大鼠旋转圈数[29]。虽然VTA易于操作,但与人类 PD 病理特征不符[30],因此有关单一VTA部位注射造模的报道较少,通常与SNc或MFB联合注射。
2.2.2 剂量
6-OHDA注射剂量、浓度及部位的选择都会影响PD模型的最终表现[31],通过文献发现,6-OHDA注射剂量从4～30 μg不等,与注射部位和点位密切相关。黄世明等[26]采用CPu四点注射法,每点注射2 μL,共8 μL,术后第2周 TH免疫荧光染色示右侧SN无明显TH阳性的DN细胞带,阳性细胞数减少且分布不均;杜越群等[32]采用单侧SNc+MFB造模,两点各注射12 μg/4 μL,术后2、4和6周PD大鼠毁损侧纹状体DAT相对放射计数较健侧分别降低了16.8%、35.9%和50.1%,且毁损侧TH阳性细胞数较健侧分别减少75.22%、81.22%和87.44%。
2.2.3 模型检测时间与持续时间
在应用6-OHDA模型的研究中,首次检测时间是一个关键的时间节点,根据大量研究发现,首次检测时间通常在造模1周以后,最广泛使用的时间是1～3周。在具体的实验操作中,模型动物首次旋转行为出现的时间与诸多造模因素密切相关,因此本文所综述内容仅供参考。李泽鸿等[33]在术后第1、2、3周分别进行APO旋转实验, 模型组在术后1周即可诱发旋转行为且次数随时间增加而升高;贾丛康等[34]在术后2、4、8、12周分别对各组大鼠的行为进行检测,其中有3只大鼠于术后2周即诱发出了旋转行为,4周后有40%的动物可诱发旋转行为,12周时旋转圈数较2、4、8 周组明显减少但仍符合模型成功的纳入标准,这提示造模4周时结果最为稳定,12周以后模型具有自我恢复的倾向。此外,刘毅等[35]在术后4周进行检测, 造模成功率达55.8%,且持续观察至术后10个月,模型大鼠仍可诱发出旋转行为,说明6-OHDA造成的模型损伤较为稳定,且持续时间长。
2.2.4 操作注意事项
关于药物的配置,要注意6-OHDA极易发生氧化反应,当溶液由透明变色至淡粉色或橘粉色时,说明药液已经氧化,应当弃用。因此在配置时要严格避光、低温操作,文献中往往以含0.02%～0.2%抗坏血酸的生理盐水溶液配置,完成后快速分装冻存,需要时取用。在进行注射操作时,进样针也应当采用锡纸包裹避光,尽量维持药物的效力。进针时应保持匀速缓慢,通常选择0.5～1.0 μL/min,留针时间选择5～15 min,以使药液更好地扩散和吸收,退针时应同样注意匀速缓慢退出,防止药液溢出。此外,许多研究者采用预先腹腔注射地昔帕明(25 mg/kg)和帕吉林 (5 mg/kg) 来促进6-OHDA的吸收,其中地昔帕明可减少 6-OHDA引起的去肾上腺素和5-羟色胺减少,帕吉林可减少6-OHDA分解,因此常在注射造模前使用,提高6-OHDA的药效[36-37]。术后通过连续1周腹腔注射青霉素,或者手术处涂抹红霉素软膏[38]的方法来预防伤口感染。关于立体定位操作,要注意齿杆与耳杆的位置关系,牛朝诗等[10]提出当门齿杆比耳杆低约2.4 mm时,可使250 g左右的SD大鼠前囟与后囟保持在一个平面。造模时,应当注意以上细节,以提高模型的成功率,减少动物的死亡率。
2.3 检测指标
通过观察动物的行为学、组织形态学、分子生物学等变化,可以判断6-OHDA模型建立是否成功,并以此探讨该方法制备大鼠PD动物模型的可行性和成功率。
2.3.1 行为学检测指标
经统计,6-OHDA模型常用的行为学检测方法包括阿扑吗啡诱导旋转实验(Apomorphine-induced rotation test),苯丙胺诱导旋转实验(DAmphetamine-induced rotation test)、圆筒实验(the cylinder test)、空场实验(the open feild test)、转棒实验(the rotarod test)等。其中46.63%的研究选择了阿扑吗啡旋转实验,17.42%的研究选择了苯丙胺旋转实验。旋转实验可用于评估动物的最大损伤程度,也是判断6-OHDA诱导的PD模型成功与否的金标准。据文献显示,在大部分研究中研究者通常采用旋转实验来鉴定模型的是否成功,另择1～3种行为学方法评估模型的其他行为学改变。详见表2。
表2 6-OHDA模型的常用行为学检测方法Table 2 Common behavioral tests of the 6-OHDA model
2.3.2 组织形态学检测
组织形态的改变通常选择尼氏染色法(Nissl’s staining)和苏木精-伊红染色法(HE staining) 。观察6-OHDA模型大鼠术后48 h的SNc部位,HE染色可见神经细胞胞体肿胀、胞核变大、核呈空泡状,且部分出现核裂解以及部分胞体溶解等,术后4周和8周可见神经细胞凝固性坏死,伴有大量胶质细胞弥漫性或局限性增生[38]。SN区域可见神经元胞体形态不规则、结构模糊、数量减少[48];尼氏染色中出现SNc及VTN区神经元数目显著减少, 尼氏体模糊, 着色较浅, 有大量胶质细胞浸润[49]。
2.3.3 分子生物学检测
为检测6-OHDA诱导的PD模型引起的一系列的分子生物学的改变,最常用的检测方法有免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)、免疫荧光法(immunofluorescent staining,IF)、蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)等。文献表明,TH是DN特有的多巴胺合成限速酶,黑质TH阳性神经元数量与DA的含量呈相同趋势,因此可作为DN的特异性标记物,通过IHC法对脑组织中的TH进行标记能很好地反映脑内DN数量的变化[48]。临床患者和PD动物模型的相同特点之一就是脑组织中的TH合成减少,因此,IHC法检测TH能很好地反映黑质多DN变化,是鉴定6-OHDA模型的重要方法。详见表3。
表3 6-OHDA模型的常用分子生物学检测方法及指标Table 3 Common molecular biological detection methods and indicators of the 6-OHDA model
2.3.4 生化指标检测
针对6-OHDA诱导的PD模型常引起一系列的神经递质、激素、代谢产物的变化,最常用的检测方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)与分光光度计法(UV spectrophotometry)等。DA是PD疾病发生发展过程中最重要的神经递质,HVA和DOPAC是DA代谢产物,可以反映DA水平[50]。通过文献可发现,ELISA和HPLC检测DA及其代谢产物的水平变化,是6-OHDA模型的一项重要检测指标。详见表4。
表4 6-OHDA模型的常用生化检测方法及指标Table 4 Common biochemical detection methods and index of 6-OHDA model
2.4 6-OHDA模型在中药药效研究中的应用
目前,6-OHDA大鼠模型已广泛应用于抗PD中药药效研究中,本文收集近年来6-OHDA大鼠模型在单味药及复方研究中的应用情况。
2.4.1 6-OHDA模型在单味中药提取物及有效组分对PD防治作用研究中的应用
崔爽等[44]采用右侧黒质单点注射6-OHDA建立模型,造模成功后予以杜仲醇提取物联合左旋多巴治疗,在给药7 d后发现联合治疗显著改善了模型大鼠运动功能的损伤,提高了黑质TH蛋白表达和DA水平,并恢复SOD、GSH-Px及NOS水平,降低了MDA水平;陈子方等[51]采用SN+VTA注射6-OHDA建立模型,持续21 d灌胃天麻提取物,发现天麻提取物低中高剂量组均有降低阿扑吗啡导致的PD大鼠旋转圈数的趋势,其中高剂量还可以显著增加水迷宫实验中平台象限距离百分比 (PT%)和停留时间百分比(T%),证明了天麻提取物能显著改善PD大鼠的运动障碍和学习记忆能力;文晓东等[52]采用单侧CPu注射,对各组大鼠脑组织中线粒体呼吸链酶复合物I、II、III、IV的活性进行了检测,发现乌梅总黄酮高剂量组可恢复PD模型脑组织中线粒体呼吸链酶复合物活性的下降,可能通过调节线粒体功能障碍等途径来保护PD大鼠的DN神经元;池彬彬等[53]采用单侧MFB损伤14d后造成PD模型,研究发现人参皂苷Rb与左旋多巴联用可预防PD异动症的发生,且Rb能显著改善大鼠纹状体内mGluR1和PV表达水平的下降;尹帅领等[54]将6-OHDA注入右侧CPu建立模型,予以造模成功大鼠肉苁蓉多糖灌胃治疗,持续10d,结果显示肉苁蓉多糖可显著恢复模型动物游泳不动时间缩短,自主活动站立次数下降的现象,增加Wnt1、βcatenin蛋白水平,降低GSK-3β mRNA水平;没食子酸是茯苓的主要活性成分提取物之一,秦劭晨等[55]通过右侧VTA注射制备PD模型,发现没食子酸可显著减少PD大鼠的旋转圈数,增加转棒停留时间,并可能通过激活Nrf2/HO-1通路来降低PD大鼠的氧化应激损伤。
2.4.2 6-OHDA模型在中药复方对PD防治作用研究中的应用
王炜为等[50]采用单侧SNc+VTA注射建立6-OHDA模型探究补肾止颤方(熟地、山茱萸、山药、肉苁蓉)的抗PD作用,在给药10 d和20 d后分别进行行为学检测,发现补肾止颤方可以在损伤早期降低PD大鼠阿扑吗啡诱导的转圈次数,增加PD大鼠DN的表达,降低神经损伤;李晓明等[56]采用6-OHDA单侧损毁SN联合附子汤灌胃建立肝阳上亢型PD模型,探究镇肝熄风汤(怀牛膝、代赭石、生牡蛎、生龙骨、生龟板、生白芍、元参、天冬、生麦芽、川楝子、茵陈、甘草)的抗PD作用机制,结果表明镇肝熄风汤可以显著降低PD大鼠中脑MDA含量,上调Nrf2和HO-1蛋白的表达;常学辉等[57]采用单侧SNc注射造模,予以龟羚帕安丸(由龟板、羚羊角、全蝎、威灵仙、厚朴等药物组成郑卫制剂Z04010162)持续30 d灌胃治疗,结果显示龟羚帕安丸可有效提高PD大鼠中脑黑质Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表达,降低P62的表达,提高细胞自噬活性;邵跃斌[58]采用单侧两点SN注射,模型成功后给与杞菊地黄丸2 g/kg(枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻)灌胃联合针刺阳陵泉穴治疗,连续治疗4周后,联合治疗组大鼠的GSH、SOD含量,BDNF表达量均显著升高;霍绮雯等[59]利用CPu两点注射6-OHDA模型探究《证治准绳·类方》中经典方剂定振丸(天麻、秦艽、全蝎、生地、熟地、当归、川穹、白芍、防风、白术、黄芪、石决明、生牡蛎、钩藤)对PD的改善作用,结果显示,定振丸能显著增高PD大鼠DA、DOPAC、HVA、5-HT、SOD、GSH-Px水平,具有改善儿茶酚胺类神经递质及黑质DN氧化应激的作用,下调Bax、Caspase-3蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达,具有抑制DN凋亡的作用;滕龙等[60]采用单侧SN两点注射,腹腔注射左旋多巴+苄丝肼建立阴虚动风证异动症模型,予以中药复方地黄方(熟地黄、钩藤、珍珠、白芍、丹参、石菖蒲、全蝎、绿茶),发现中药复方地黄方可降低AIM评分,改善左旋多巴诱发的异动症现象。
PD是以震颤、肌强直、运动迟缓为主要临床表现的神经退行性疾病,为了进一步探究其病因及治疗,研究者们根据PD的临床和病理表现建立不同的动物模型,本综述总结了6-OHDA模型的特点,为选择6-OHDA模型的研究者提供一些参考:(1)6-OHDA模型最常用的品系是SD或Wistar大鼠,为避免雌性大鼠激素周期等对行为学实验的干扰,若无特殊研究需求,可选雄性大鼠;(2)造模大鼠的品系及体重应当与注射位点坐标所参考的脑立体定向图谱基本一致,尽量避免因种属和重量带来的造模不稳定性,提高成功率。(3)双侧损伤创伤较大,死亡率高,推荐使用单侧损伤。(4)6-OHDA注射部位、剂量的不同,可诱导不同的损伤类型,SN和MFB部位注射所导致的DA能神经元损伤较大,通常用于制备晚期PD模型;CPu注射部位造成的DN损伤较低,可用于制作早中期PD模型;VTA部位通常与SNc或MFB联合注射,增加模型的成功率。(5)6-OHDA注射后导致DN发生渐近性损伤,腹腔或皮下注射DA受体激动剂APO或释放剂D-amp会诱导动物产生向健侧或患侧旋转的行为,通常以旋转实验中的评价转圈次数(r/min)指标来作为模型是否成功的标准。(6)6-OHDA操作简单、动物成本低、行为学变化持续时间长,不易自行恢复,但无法模拟PD患者产生LB的病理特征,因此在选择该模型时需要注意,若要探究LB的相关成因和机制,不宜选择6-OHDA模型。(7)抗PD中药研究的应用中,通常采用灌胃给药的干预方式,少数采取腹腔注射的干预方式。部分研究选择造模完成后,先通过旋转实验将造模成功的动物纳入,再行分组干预,也有部分研究选择在造模前提前干预,以探究药物的预防作用,但不管选种方式,应注意6-OHDA造成的模型损伤较大,因此干预周期不可太短。
综上所述,通过分析 6-OHDA大鼠模型的动物品系、性别、体重、造模部位和检测方法,以期为抗PD中药的药效研究提供模型方案参考。
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