刘晓霞 陈剑华 郭旭丽 李卫霞 王雪玲 熊南燕 （河北工程大学医学院，邯郸 056038）
抗生素在感染性疾病治疗方面历史悠久、贡献突出，但随之出现了细菌耐药现象，导致疗效降低。为提高抗生素疗效，临床常将具有清热、解毒等作用的中药制剂，如喜炎平注射液、疏风解毒胶囊等，与抗生素联用治疗感染性疾病，临床认为中药制剂与抗生素联用具有协同作用［1-2］。为明确其联用的作用机制，本研究将痰热清与头孢曲松钠联用于金黄色葡萄球菌感染小鼠，研究感染小鼠腹腔巨噬细胞极化情况，探讨其是否可通过影响巨噬细胞极化发挥作用，为临床应用提供依据。
1.1 材料 昆明小鼠购自河北医科大学实验动物中心；
PE-抗小鼠CD80 抗体、 FITC-抗小鼠CD206 抗体购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；
SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time 购自日本TaKaRa 公司；
引物由 Invitrogen 公司 合成；
兔抗 鼠iNOS、TNF-α、IL-6、 IL-1β、Arg-1、Fizz-1、TGF-β、STAT1、p-STAT1、IRF5
抗体、HRP-羊抗兔IgG 抗体购自ThermoFisher 公司；
兔抗鼠Ym-1 抗体购自STEMCELL Technologies；
26001-25金黄色葡萄球菌菌株购自北京市药品生物制品检定所。
1.2 方法
1.2.1 动物造模 6～8周龄昆明小鼠60只，雌雄各半，体温相近（相差≤0.2 ℃），腹腔注射金黄色葡萄球菌0.2 ml （9×108个/ml），1 h 后电子体温计经直肠测体温，选择体温≥37.2 ℃小鼠40只，按体温高低均分为4 组：模型组、头孢曲松钠组、痰热清组和痰热清+头孢曲松钠组，每组10 只，对照组为10 只正常未处理小鼠。对照组和模型组腹腔给予生理盐水（70 mg/kg），其他三组分别腹腔给予头孢曲松钠 （70 mg/kg）、痰热清（13 mg/kg）和头孢曲松钠+痰热清（70 mg/kg+13 mg/kg），2 次/d，连续7 d。第7 天给药后2 h采集小鼠腹腔巨噬细胞。
1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞分离 小鼠摘眼球和颈动脉放血至血流尽，75%乙醇浸泡5 min（头部不浸入），沿腹中线剪开皮肤，充分暴露腹膜，5 ml预冷无菌PBS冲洗，收集液体至离心管，冲洗3次，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS 重悬，洗涤3 次，收集细胞，RPMI1640 完全培养基重悬细胞，接种于无菌培养皿，培养2 h，弃上清，无菌PBS 洗涤3 次，去除未贴壁细胞，得到贴壁细胞即小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度为2×106个/ml。
1.2.3 流式细胞术检测巨噬细胞M1、M2 极化情况 取1.2.2 中的细胞悬液100 µl，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，含0.1%BSA的PBS洗涤2次，加入含0.1%BSA 的PBS 重悬细胞，加入2 µl PE-抗小鼠CD80 抗体、2 µl FITC-抗小鼠CD206 抗体 混 匀， 4 ℃孵 育 30 min，加 入1 ml 含0.1%BSA 的PBS， 1 000 r/min 离 心5 min，弃 上 清，加 入0.5 ml 含0.1%BSA的PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。
1.2.4 小鼠腹腔巨噬细胞总RNA 提取及RT-qPCR检测 TRIzol 法提取细胞总RNA，取1.2.2 中细胞悬液，PBS洗涤2次，加入500 µl TRIzol涡旋振荡，使细胞完全裂解，静置5 min。加入200 µl 三氯甲烷 涡旋振荡15 s，静置2 min，4 ℃、12 000 r/min 离心 15 min，取上清加至新EP 管，加入等量异丙醇混匀，室温静置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min， 弃上清，加入1 ml 75%乙醇室温静置2 min，4 ℃、 7 500 r/min 离心5 min，弃上清，重复洗涤2 次。将EP 管室温晾干，加入适量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀，检测RNA 浓度和纯度，以总RNA 为模板转录为cDNA，进行RT-qPCR 反应，反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 µl、ddH2O 8.5 µl、cDNA 2 µl、 正反向引物各1 µl，引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 30 s，1个循环预变性；
95 ℃ 5 s变性；
60 ℃ 30 s退火延伸，40个循环；
95 ℃ 15 s；
60 ℃ 60 s；
95 ℃ 15 s， 1 个循环。2-ΔΔCt法计算并分析iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA相对表达。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences
1.2.5 Western blot 检测巨噬细胞相关蛋白表达 取上述细胞悬液，PBS 洗涤2 次，RIPA 裂解，提取总蛋白，BCA 法定量。取各组蛋白20 µl 进行SDDPAGE 电泳，电转至PVDF 膜，含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4 次，10 min/次，加入HRP-二抗室温孵育2 h，TBST 洗膜。超敏ECL 化学发光试剂盒显影曝光，Image J软件分析蛋白灰度值。
1.3 统计学分析 应用GraphPad Prism 8 软件处理数据，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey 法，P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 小鼠腹腔巨噬细胞极化情况 模型组、头孢曲松钠组、痰热清组、痰热清+头孢曲松钠组M1 型（CD86阳性）巨噬细胞比例明显高于对照组，痰热清组与痰热清+头孢曲松钠组均明显高于模型组和头孢曲松钠组（F=24.030，P＜0.05）；
而模型组与头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05），痰热清组与痰热清+头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组M2型（CD206阳性）巨噬细胞比例差异无统计学意义（F=1.608，P＞0.05，图1）。
图1 小鼠腹腔巨噬细胞极化情况Fig.1 Polarization of peritoneal macrophage in mice
2.2 小鼠腹腔巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA 表达 头孢曲松钠组、痰热清组以及痰热清+头孢曲松钠组M1 型巨噬细胞极化标志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达明显高于对照组，痰热清组和痰热清+头孢曲松钠组明显高于模型组和头孢曲松钠组（P＜0.01），而模型组与头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05），痰热清组与痰热清+头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组M2 型巨噬细胞极化标志物Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。
表2 小鼠腹腔巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA表达（±s，n=10）Tab.2 mRNA level of iNOS， TNF-α， IL-6， IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1 and TGF-β of peritoneal macrophage in mice （±s，n=10）
表2 小鼠腹腔巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA表达（±s，n=10）Tab.2 mRNA level of iNOS， TNF-α， IL-6， IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1 and TGF-β of peritoneal macrophage in mice （±s，n=10）
Note：Compared with control group， 1）P＜0.05；
compared with model group， 2）P＜0.05；
compared with ceftriaxone sodium group， 3）P＜0.05.
2.3 小鼠腹腔巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β 蛋白表达 模型组、头孢曲松钠组、痰热清组以及痰热清+头孢曲松钠组M1型巨噬细胞极化标志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白表达明显高于对照组，痰热清组和痰热清+头孢曲松钠组明显高于模型组和头孢曲松钠组（P＜0.05），而模型组与头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05），痰热清组与痰热清+头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组M2 型巨噬细胞极化标志物Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05，图2），与mRNA结果一致。
图2 小鼠巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β蛋白表达Fig.2 Protein expressions of iNOS，TNF-α，IL-6，IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1， TGF-β of peritoneal macrophage in mice
2.4 小鼠腹腔巨噬细胞IRF/STAT信号通路相关蛋白表达 Western blot 结果显示，模型组、头孢曲松钠组、痰热清组及痰热清+头孢曲松钠组p-STAT1和IRF5 蛋白表达明显高于对照组，痰热清组和痰热清+头孢曲松钠组明显高于模型组和头孢曲松钠组（P＜0.05），而模型组与头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05），痰热清组与痰热清+头孢曲松钠组差异无统计学意义（P＞0.05）。各组STAT1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。
图3 小鼠巨噬细胞IRF/STAT信号通路相关蛋白表达Fig.3 Protein expressions of IRF/STAT signaling pathway of peritoneal macrophage in mice
痰热清注射液由连翘、山茱萸、黄芩、金银花、藜芦5 种成分组成，含有咖啡酸、鹅去氧胆酸、黄芩苷、绿原酸、熊去氧胆酸5种活性物质，具有清热、解毒、化痰等作用，用于肺炎早期、急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作及上呼吸道感染治疗［3］。临床将其与抗生素联用治疗呼吸道疾病，可提高疗效、降低不良反应发生率、缩短住院和抗生素使用时间，但未进行机制研究［4］。宋福江［5］对痰热清成分及抗菌作用机制进行研究发现，痰热清可通过抑制细菌细胞壁和脂肪酸合成发挥体外抗菌作用；
李文等［6］发现痰热清与常规西药治疗风热型气管-支气管炎后，中医症候群改善优于单用西药治疗，可能与联用下调IL-4、IL-8、IL-10 水平有关；
李芷悦［7］研究发现痰热清与左氧氟沙星联用于铜绿假单胞菌感染大鼠，可通过抑制炎症反应和氧化应激提高疗效。但未发现二者联用对巨噬细胞影响的研究。
巨噬细胞属于机体固有免疫细胞，在抗感染免疫中发挥重要作用，受到刺激可发生极化，分化为经典活化巨噬细胞（M1 型）和旁路活化巨噬细胞（M2型），二者表型、分泌细胞因子、功能均不同，M1型巨噬细胞能有效清除病原体，并引起炎症损伤和组织损伤，M2 型巨噬细胞具有抗炎作用，对炎症刺激不敏感，促进组织修复［8-9］。本研究发现单用痰热清、痰热清+头孢曲松钠联用均可促进巨噬细胞M1型分化，且M1 型标志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 及蛋白表达显著增加。iNOS 可促进NO 生成，促进氧化应激，本研究iNOS 表达增加与李芷悦［7］发现的痰热清与左氧氟沙星联用可抑制氧化应激不符，可能是其针对氧化应激进行的是SOD 和MDA 研究，并未检测NO，且其研究的是整个肺组织氧化应激情况，而本研究仅针对巨噬细胞进行研究；
本研究显示TNF-α、IL-6 表达增加，与李文等［6］、李芷悦［7］研究的痰热清与抗生素联用下调炎症因子表达不符，原因可能在于二人分别针对血浆和整个肺组织进行研究。
巨噬细胞极化受多种信号分子和转录因子调控，IRF/STAT 信号通路即为其中之一，STAT1 是 一种连接膜受体与效应器信号转导的重要分子，其磷酸化后形成二聚体进入细胞核，启动靶基因转录，既往研究发现其可促进M1 型巨噬细胞极化［10-11］；
极化后的M1 型巨噬细胞IRF5 分子表达上调，进而诱导M1 相关细胞因子分泌［11-12］。本研究也显示，单用痰热清、痰热清+头孢曲松钠联用STAT1磷酸化水平、IRF5 分子表达明显高于其他三组，提示其可能通过调节IRF/STAT信号通路促进M1型巨噬细胞极化。
综上，痰热清与头孢曲松钠联用于金黄色葡萄球菌感染小鼠，可通过促进M1 型巨噬细胞分化促进iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β 表达，进而促进NO 产生和炎症反应，增强机体抗感染能力，可能通过调节IRF/STAT信号转导途径实现。
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