余 瑛 （赣州市肿瘤医院妇科，赣州 341000）
宫颈癌（cervical cancer，CC）是威胁全球女性的第二大恶性肿瘤，其发病率逐年升高，且呈年轻化趋势［1-2］。目前，临床上治疗CC 主要采用化疗、放疗及手术等方法，但这些治疗手段会损伤患者的免疫功能，不利于患者的生存健康，因此寻找安全有效的CC 治疗方法，是临床研究的重点和难点之一［3-4］。CC 发生、发展及结局与机体免疫功能抑制关系密切，而肿瘤免疫应答需要机体免疫系统有效识别并分泌肿瘤抗原，促进特异性T细胞活化发挥作用［5-6］。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡因子配体-1（programmed death receptor-1，PD-L1）在肿瘤表面及外周血T 细胞中表达较高，且能够调节机体免疫效应，促进肿瘤生长，是近年来免疫学研究的“明星分子”［6-7］。木犀草素是从木犀草的茎叶中提取的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种生物学效应［8-9］。近年研究发现，木犀草素可抑制肠癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌症细胞的增殖和生长，且能够增强肿瘤对化疗药物的敏感性，并增强化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］。木犀草素抗肿瘤的分子机制复杂，且木犀草素对CC患者素外周血T细胞亚群及PD-1/PD-L1通路的影响未见报道，本文对此进行探讨，以期为临床用药提供参考。
1.1 材料
1.1.1 动物 清洁级健康雌性SD 大鼠60 只，体质量200～220 g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（粤）2019-0002，动物质量合格证号为省科委2000A027。所有大鼠于赣州市肿瘤医院动物房中饲养，饲养条件：自然光照，自由饮食、饮水，温度25 ℃，相对湿度50%，噪声＜80 分贝，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本研究经赣州市肿瘤医院动物伦理委员会批准同意，批号为 IACUC-01（20180917）。试验符合3R原则。
1.1.2 主要试剂及仪器 人宫颈癌HeLa 细胞株（货号：HZ-CC100769，上海恒斐生物科技有限公司）；
木犀草素（货号：BZ008，山东临沂艾泽拉斯生物科技有限公司，规格：20 mg）；
血管内皮生长因子（VEGF） ELISA 试剂盒（货号：QY-MB10210，上海乔羽生物科技有限公司）；
IL-10 ELISA 试剂盒（货号：ml028604，苏州瑞诺德生物科技有限公司）；
转化生长因子-β（TGF-β） ELISA 试剂盒（货号：R31808，上海圻明生物科技有限公司）；
PD-1 抗体（货号：ab228857）、PD-L1 抗体（货号：ab213480）、BCA 蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶（货号分别为P0768、P0231），均购自美国Pierce 公司；
beamCyte-1026 流式细胞仪（上海然哲仪器设备有限公司）；
蛋白电泳仪、半干转膜仪（美国Bio-Rad 公司，型号1659001、Trans-Blot SD）等。
1.2 方法
1.2.1 人宫颈癌HeLa 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞株常规复苏，置于RPMI1640 完全培养液中，37 ℃、5%CO2培养24 h，细胞处于对数生长期时终止培养，1 200 r/min 离心10 min，制备1×107个/ml 宫颈癌HeLa细胞悬液备用。
1.2.2 大鼠CC 模型建立及分组给药 参照文献［11］构建大鼠CC 模型，具体操作方法为：取50只大鼠，左侧腋窝处皮下注射0.5 ml HeLa 细胞悬液，7 d后大鼠左腋窝处有明显肿瘤结节生长为造模成功。取造模成功大鼠40只，随机分为CC 模型组、木犀草素低（5 mg/kg）、中（25 mg/kg）、高（50 mg/kg）剂量组，每组10只，另取10只SD雌性大鼠，于左侧腋窝处皮下注射0.9%氯化钠（NaCl）溶液0.5 ml，7 d 后作为空白对照组（Control 组）［12］。各组造模成功后开始给药，木犀草素以生理盐水配置为0.50 mg/ml、2.50 mg/ml、5.00 mg/ml 的混悬液，木犀草素组大鼠 10 ml/kg 经腹腔注射给药，Control 组与CC 组注射给予等剂量生理盐水，各组连续给药30 d，2次/d。
1.2.3 大鼠标本采集 各组大鼠于末次给药后 12 h，称取大鼠体质量，麻醉处死，取目眶血6 ml 置于肝素抗凝管中，解剖大鼠，取肿瘤组织，称取瘤体质量，并用游标卡尺检测瘤体的短径（a）、长径（b）。
1.2.4 各组大鼠瘤体体积及抑瘤率计算 肿瘤体积=1/2×a×b2；
抑瘤率（%）=（1-给药组平均肿瘤重量/模型组平均肿瘤重量）×100%。
1.2.5 各组大鼠肿瘤组织中VEGF 表达及外周血IL-10 和TGF-β 含量检测 检测瘤体体积后取各组大鼠0.5 g肿瘤组织，组织匀浆器匀浆，离心，取上清液，按ELISA 试剂盒说明书方法检测VEGF 含量。取0.5 ml 目眶血3 000 r/min 离心15 min，取上清按ELISA试剂盒说明书方法检测IL-10与TGF-β含量。
1.2.6 各组大鼠外周血T淋巴亚群检测 取0.5 ml目眶血加入红细胞裂解液，冰浴30 min，4 ℃、 1 000 r/min 离心5 min 后弃上清液，PBS 洗涤，细胞计数，调整浓度为1×107个/ml，取100 µl细胞液，加入大鼠PE-anti-mCD4、FITC-anti-mCD8、PE-anti-CD25 APC 单克隆抗体，混匀后4 ℃避光静置40 min，PBS洗涤，4 ℃、1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入0.5 ml PBS 重悬，流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4+、CD8+、CD4+CD25+T百分比，计算其比值。
1.2.7 Western blot检测外周血及肿瘤组织中PD-1、PD-L1 蛋白相对表达 取新鲜抗凝血，淋巴细胞分离液分离外周单核细胞，磷酸缓冲液（PBS）清洗 2 次，加入组织裂解液RIPA 冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min 离心15 min，收集上清液。分别取上清液与1.2.5 中组织匀浆液，按BCA 试剂盒说明书测定蛋白浓度。BCA 法测定蛋白浓度并灌制SDSPAGE 后，分别取200 µg蛋白电泳，将全部蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉溶液37 ℃摇床封闭2 h，将目的蛋白条带置于孵育盒中，加入抗体PD-1 （1∶1 000）、PD-L1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000） 4 ℃冰箱中孵育过夜。TBST 漂洗3 次，加入1∶1 000 的羊抗兔二抗溶液，室温下摇床孵育2 h，TBST 漂洗3 次，增强化学发光法显色，凝胶成像仪观察条带并拍照，采用Image J软件分析各组蛋白相对表达。
1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较行LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 大鼠体质量、瘤体质量及体积、抑瘤率检测结果 与Control 组相比，CC 组大鼠体质量降低（P＜0.05），瘤体体积及质量升高（P＜0.05）；
与CC 组相比，木犀草素低、中、高剂量组大鼠体质量、抑瘤率均升高（P＜0.05），瘤体体积及质量均降低（P＜0.05），且木犀草素各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见表1、图1。
表1 各组大鼠体质量、瘤体质量、抑瘤率结果表（±s，n=10）Tab.1 Body weight， tumor weight and tumor inhibition rate of rats in each group （±s，n=10）
表1 各组大鼠体质量、瘤体质量、抑瘤率结果表（±s，n=10）Tab.1 Body weight， tumor weight and tumor inhibition rate of rats in each group （±s，n=10）
Note：1）P＜0.05 vs Control group；
2）P＜0.05 vs CC group；
3）P＜0.05 vs luteolin low dose group；
4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.
图1 各组大鼠肿瘤组织外观图Fig.1 Appearance of tumor tissue in each group
2.2 大鼠肿瘤组织VEGF 含量检测结果 与Control 组相比，CC 组大鼠VEGF 含量升高（P＜0.05）；
与CC 组相比，木犀草素低、中、高剂量组大鼠VEGF 含量降低（P＜0.05），且木犀草素各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见表2。
表2 各组大鼠肿瘤组织VEGF含量检测结果（±s，n=10）Tab.2 Detection results of VEGF content in tumor tissue of rats in each group （±s，n=10）
表2 各组大鼠肿瘤组织VEGF含量检测结果（±s，n=10）Tab.2 Detection results of VEGF content in tumor tissue of rats in each group （±s，n=10）
Note：1）P＜0.05 vs control group；
2）P＜0.05 vs CC group；
3）P＜0.05 vs luteolin low dose group；
4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.
2.3 各组大鼠外周血T 细胞亚群CD8+T、CD4+T 及CD4+CD25+T 百分比结果 与Control 组相比，CC 组大鼠外周血T 细胞亚群CD4+CD25+T 占比升高（P＜0.05），CD4+T 及CD8+T 占比降低（P＜0.05）；
与CC 组相比，木犀草素低、中、高剂量组大鼠外周血T 细胞亚 群CD4+CD25+T 占 比 降 低（P＜0.05），CD4+T 及CD8+T 占比升高（P＜0.05），且木犀草素各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见表3。
表3 各组大鼠外周血T细胞亚群CD8+T、CD4+T及CD4+CD25+T百分比结果（xˉ±s，n=10）Tab.3 Percentages of T cell subsets CD8+T， CD4+T and CD4+CD25+T in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）
表3 各组大鼠外周血T细胞亚群CD8+T、CD4+T及CD4+CD25+T百分比结果（xˉ±s，n=10）Tab.3 Percentages of T cell subsets CD8+T， CD4+T and CD4+CD25+T in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）
Note：1）P＜0.05 vs control group；
2）P＜0.05 vs CC group；
3）P＜0.05 vs luteolin low dose group；
4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.
2.4 各组大鼠外周血免疫抑制因子IL-10和TGF-β含量检测结果 与Control 组相比，CC 组大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量升高（P＜0.05）；
与CC 组相比，木犀草素低、中、高剂量组大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量降低（P＜0.05），且木犀草素各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见表4。
表4 各组大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量检测结果（±s， n=10）Tab.4 Detection results of IL-10 and TGF-β contents in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）
表4 各组大鼠外周血IL-10 和TGF-β 含量检测结果（±s， n=10）Tab.4 Detection results of IL-10 and TGF-β contents in peripheral blood of rats in each group （±s，n=10）
Note：1）P＜0.05 vs control group；
2）P＜0.05 vs CC group；
3）P＜0.05 vs luteolin low dose group；
4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.
2.5 各组大鼠外周血单核细胞中PD-1、PD-L1蛋白相对表达结果 与Control 组相比，CC 组大鼠外周血PD-1、PD-L1 蛋白表达升高（P＜0.05）；
与CC 组相比，木犀草素低、中、高剂量组大鼠外周血PD-1、 PD-L1 蛋白表达降低（P＜0.05），且木犀草素各剂量组上述指标呈剂量依赖性，见图2、表5。
图2 外周血单核细胞中PD-1、PD-L1蛋白表达免疫印记图Fig.2 Immunoblotting of PD-1 and PD-L1 protein expressions in peripheral blood monocytes
表5 各组大鼠外周血单核细胞中PD-1、PD-L1 蛋白表达（±s，n=10）Tab.5 Protein expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood mononuclear cells of rats in each group（xˉ±s，n=10）
表5 各组大鼠外周血单核细胞中PD-1、PD-L1 蛋白表达（±s，n=10）Tab.5 Protein expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood mononuclear cells of rats in each group（xˉ±s，n=10）
Note：1）P＜0.05 vs control group；
2）P＜0.05 vs CC group；
3）P＜0.05 vs luteolin low dose group；
4）P＜0.05 vs luteolin medium dose group.
CC 严重威胁女性健康和生命安全［1］。CC 的动物模型对提高宫颈癌的实验研究水平有重要意义［13］。将人类肿瘤种植于裸鼠，可保留人类肿瘤部分病理学、生物学特性［14］。本研究发现在大鼠左侧腋窝处皮肤注射人类宫颈癌HeLa 细胞悬液后，与Control 组相比，CC 组大鼠出现肿瘤结节，体质量减轻、CC 病灶体积及肿瘤重量增大，且肿瘤组织中VEGF 表达升高，提示大鼠皮下注射人类宫颈癌HeLa细胞悬液后出现肿瘤，且肿瘤组织中血管生成较多，预示肿瘤血管较丰富，肿瘤恶化可能较高，造模成功。中药天然提取物木犀草素具有抗肿瘤作用，且安全性、有效性较高［10］。如GAO 等［14］及YAO等［15］发现不同浓度的木犀草素可抑制乳腺癌及大肠癌细胞转移，提示木犀草素具有较好的抗肿瘤作用。但木犀草素对CC 的治疗作用未见报道。考虑到木犀草素对CC 也可能有治疗作用，本研究建立大鼠CC 模型，对此进行验证，发现木犀草素组低、中、高剂量组大鼠体质量升高，CC 病灶体积及肿瘤重量、肿瘤组织中VEGF 表达均低于CC 模型组，提示给予肿瘤大鼠木犀草素治疗后，肿瘤体积大小及肿瘤血管生成均降低，木犀草素可抑制CC 模型大鼠肿瘤生长及血管生成，对CC 具有一定治疗作用，然而其治疗CC 的具体作用机制还不明确，下一步研究将对此继续探究。
近来研究发现，人体免疫功能够监视、杀灭癌细胞，且免疫治疗成为当今肿瘤治疗和研究的一大热 点［7，16］。T 细 胞 可 表 达 多 种 重 要 的 膜 分 子 如CD4+T、CD8+T 等，并参与T 细胞识别抗原、活化、增殖而介导机体免疫反应［17］。另外CD4+T细胞可在抗原提呈细胞的协助下，识别肿瘤细胞分泌的可溶性抗原，继而释放多种细胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4 等），促进B细胞、巨噬细胞、NK细胞的激活，帮助其杀伤肿瘤细胞；
CD8+T 可与恶性肿瘤表面的抗原-Ⅰ及β2微球蛋白结合形成特异性复合物，使CD8+T淋巴细胞表面受体TCR 及相关信号分子聚集于复合物周围，导致毒性T 淋巴细胞通过分泌含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒直接导致癌细胞破坏，或间接分泌IFN-γ 和TNF 等细胞因子杀伤癌细胞［17］。而CD4+T 细胞亚群中的CD4+CD25+T 通过分泌免疫抑制因子TGF-β、IL-10 因子，抑制自然杀伤细胞激活，减少自然杀伤细胞对肿瘤细胞的毒害及杀伤作用，发挥免疫抑制效应［18］。如陈志刚等［19］发现在CC患者外周血中免疫抑制因子CD4+CD25+T 及TGF-β、IL-10 水平均明显升高，提示CC 患者体内可能存在T 淋巴细胞亚群分泌异常及免疫抑制现象。本研究发现，CC 组大鼠外周血T 细胞亚群CD8+T、CD4+T 水平低于Control 组，CD4+CD25+T、IL-10 和TGF-β 水平高于Control 组，提示CC 组大鼠体内具有提高免疫功能作用和杀伤细胞作用的CD4+T、CD8+T 细胞减少，有抑制机体免疫功能、减少癌细胞杀伤力作用的CD4+CD25+T 细胞分泌增多，提示CC 大鼠肿瘤生长作用可能与T 淋巴细胞亚群分泌异常，机体免疫功能降低有关。
研究证实表达于活化的T 细胞（CD4+T、CD8+T）中的PD-1，可与癌细胞中的受体PD-L1 结合，从而抑制T 淋巴细胞的增殖和分化，导致T 细胞功能减弱、丧失甚至消失而损害机体免疫功能，此外CD4+T细胞中的PD-1 与受体PD-L1 结合后会吸引更多的SHP-2 磷酸酶去磷酸化下游Syk 和磷脂酰肌醇3 激酶，使机体免疫功能传递出抑制信号并阻碍淋巴细胞及CD4+T 增殖活化，而减弱机体发挥抗肿瘤效应［20-21］。MANDAI 等［22］发现阻断PD-1 与PD-L1 结合后，CD4+T、CD8+T细胞比例升高，机体肿瘤生长缓慢且控制较好，提示抑制PD-1/PD-L1 通路激活，可逆转CD4+T、CD8+T 细胞受抑制状态，加强并维持机体内源性免疫抗肿瘤效应。本研究发现，CC组大鼠外周血单核细胞中PD-1、PD-L1 表达明显高于Control组，提示CC 大鼠机体抗肿瘤作用减弱、肿瘤生长较快可能与PD-1/PD-L1 通路激活，CD4+T、CD8+T 细胞免疫受抑制，T 细胞活化程度和杀伤能力降低有关。木犀草素是否通过抑制PD-1/PD-L1 通路表达调控机体免疫，发挥抗肿瘤作用，文献研究较少。本研究发现，与CC 组相比，木犀草素低、中、高剂量组大鼠外周血PD-1、PD-L1表达降低，T细胞亚群CD8+T、CD4+T 升高，免疫抑制因子CD4+CD25+T、IL-10 和 IL-6 分泌减少，提示木犀草素各剂量组大鼠外周血PD-1/PD-L1 通路被抑制，机体免疫功能处于激活状态，提示木犀草素可能通过抑制CC 模型大鼠外周血PD-1、PD-L1表达，逆转CD4+T、CD8+T细胞受抑制状态，提高机体免疫功能来发挥抗肿瘤效应。
综上所述，木犀草素可能通过抑制CC 模型大鼠外周血PD-1、PD-L1表达，逆转CD4+T、CD8+T细胞受抑制状态，调高机体免疫功能来抑制肿瘤生长。为临床治疗CC 和阐明木犀草素抗肿瘤机制提供一定的参考。但本研究也存在一定的不足，未设置通路抑制剂，木犀草素抗肿瘤分子机制复杂，也可能通过其他途径提高机体免疫功能，发挥抗肿瘤机制，有待后续研究。
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