王德丽，滕 颖，李 翠，李旭妮，肖 璐，李伟杰，王 芳，曲鸿飞
(中国兽医药品监察所，北京 100081)
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever，ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病[1]，以高热、皮肤发绀等为主要特征，死亡率高达100%，给养猪业造成了重大经济损失。ASFV属于非洲猪瘟病毒科，为双链DNA病毒，病毒基因组约170～193 kb[2]，包含150～167个开放阅读框，编码100多个蛋白[3]。
目前ASFV已在我国定殖并形成较大污染面，应毫不放松抓好非洲猪瘟常态化防控。利用诊断制品开展非洲猪瘟感染检测与早期诊断是目前预防和控制本病的重要手段。2019年以来，申请非洲猪瘟类诊断制品注册申报数量一直居高不下，但因注册申报资料存在各种问题，不符合注册要求比例较高。鉴于此，对我国非洲猪瘟诊断制品注册申报情况、评审评价政策以及不符合注册要求的原因进行了分析，并提出了相关建议，供非洲猪瘟诊断制品研发、注册人员参考。
截至2021年底，农业农村部兽药评审中心共收到非洲猪瘟诊断制品注册申请226份，共计89个产品(存在同一个产品因不符合注册要求而重复提交注册申请的情况，以下均按产品统计)，其中不符合注册要求产品52个，处于注册过程中的产品27个，批准发公告的产品10个。
1.1 已批准产品情况 截至2021年底，批准发公告10个产品，包括8个核酸检测试剂盒、1个抗原荧光微球检测试纸条和1个抗体检测试剂盒，详见表1。
表1 已批准非洲猪瘟诊断制品Tab 1 Licensed ASF diagnostic test kits
1.2 产品类型分析 申报的89个产品中，包括核酸检测试剂盒、抗原检测试剂盒和抗体检测试剂盒三大类。核酸检测试剂盒共52个产品，占非洲猪瘟诊断制品总数的58%。其中荧光PCR试剂盒数量最多，为38个；
其次为等温扩增试剂盒，为13个；
普通PCR试剂盒仅1个。抗原检测试剂盒共10个产品，占非洲猪瘟诊断制品总数的11%。其中大多数为免疫层析试纸条，包括5个胶体金试纸条、1个乳胶微球试纸条和1个荧光微球试纸条；
其余为3个ELISA抗原检测试剂盒。抗体检测试剂盒共27个，占非洲猪瘟诊断制品总数的30%。其中，ELISA抗体检测试剂盒为20个；
免疫层析抗体检测试纸条为7个(胶体金试纸条6个，乳胶微球试纸条1个)。
1.3 检测靶标分析 根据注册申报资料统计，核酸检测的主要靶标基因为P72、CD2v和MGF；
抗原检测的主要检测靶标为P72蛋白和P30蛋白；
抗体检测主要靶标为P72蛋白、P30蛋白、P54蛋白及CD2v蛋白等的抗体。
2.1 注册资料要求 为推进兽医诊断制品的评审改革，近几年，农业农村部畜牧兽医局会同农业农村部兽药评审中心积极修订兽医诊断制品的注册资料要求，保证敏感特异的评审标准不降低的前提下，逐步减少注册资料的项目要求。2020年9月29日，农业农村部发布新的《兽医诊断制品注册分类及注册资料要求》(农业农村部公告第342号)[4]。因此根据非洲猪瘟诊断制品提交注册申请时间的不同，按照不同的注册资料要求进行评审。2020年10月15日前已申请的，按照农业部公告第2335号执行[5]；
2020年10月15日后申请的，按照农业农村部公告第342号执行。
2.2 评审工作机制 2021年1月21日，农业农村部发布新的《兽药注册评审工作程序》(农业农村部公告第392号)，实施评审中心专家主审与兽药注册评审专家库其他专家咨询相结合的兽药注册评审工作机制[6]。该文件明确要求，原则上对每个兽药注册申请的评审，初次评审和复评审均不超过一次。这意味着，凡是需要再次提交初审会讨论的产品，尤其是涉及修改质量标准核心检验项目，均予以退审。这也是目前兽药注册退审率高的一个重要原因。
2.3 评审工作方式 2019年，为应对非洲猪瘟疫情，满足防控需求，农业农村部畜牧兽医局在农牧便函〔2019〕276号明确提出对ASFV检测试剂盒予以优先评审；
初审对试剂盒质量标准无修改意见的，可在补充其他材料的同时开展质量复核检验工作。目前农业农村部已批准的非洲猪瘟诊断制品可以满足市场非洲猪瘟诊断检测需求，且非洲猪瘟诊断制品申报数量大。从2022年9月19日起非洲猪瘟诊断制品不再实行优先评审。
2.4 简化评审要求
2.4.1 按2335号公告评审的产品 农牧便函〔2019〕411号(以下简称“便函”)中对非洲猪瘟诊断类制品的注册资料要求进行了相应简化。一是按照2335号公告要求，凡与我国已批准上市销售、检测方法和检测标的物相同的同类诊断制品相比，无根本改进的诊断产品不作为新兽药审批[5]；
但鉴于当时非洲猪瘟检测试剂需求量大，便函中规定对不符合新兽药定义但经评审和检验认为产品质量符合要求的，不再核发新兽药注册证书，对具备生产条件的相关企业核发产品批准文号。二是按照2335号公告评审的制品，按照“老人老办法、新人新办法”要求补充比对试验报告。2019年2月27日，农业农村部公告第138号公布了国家非洲猪瘟参考实验室、专业实验室和区域实验室[7]。对138号公告发布前已申请注册的制品，不再要求补充比对试验报告；
138号公告发布后申请注册的产品，可在注册评审复审前提供比对报告；
而且非洲猪瘟区域实验室出具的比对试验报告也予以认可。三是，临床试验研究中阳性样品数量不做硬性要求。
2.4.2 按342号公告评审的产品 仅申请注册为创新型兽医诊断制品的，需要提供3家兽医实验室的评价试验报告；
申请注册为改良型兽医诊断制品的，不需要提供评价试验报告。而且临床试验研究中阳性样品数量仍不做硬性要求。
89个产品中，不符合注册要求比例高达58%。现根据试剂盒检测原理将原因分类汇总如下。
3.1 共性问题 一是申报资料不全，缺少必要的研究数据。如研究报告中检测的样本来源与背景不清等。二是申报资料前后逻辑错误，难以评价申报资料和试验数据的真实性。如多个研究报告的试验时间前后矛盾等。三是制品成品检验标准规定难以控制产品质量。如敏感性检验标准中不同稀释度质控品缺少对应检测值范围规定。四是质控品问题。如敏感性质控血清未采用经典方法(如IFA等)进行检验和标定。
3.2 分子生物学试剂盒存在的其他问题 引物、探针选择依据方面，缺少对引物及探针适用性分析报告。针对多重PCR试剂盒，缺少双重荧光与单荧光敏感性比较研究报告。针对有冻干组分的试剂盒，缺少冻干工艺系统研究报告。
3.3 免疫学试剂盒存在的其他问题 包被抗原的选择依据方面，缺少采用混合蛋白与单个蛋白分别作为包被抗原进行敏感性比对的研究报告。表达蛋白鉴定方面，表达蛋白的western-blot分析缺少用非洲猪瘟病毒阳性血清进行测定的试验数据。生产工艺方面，缺少抗原包被工艺和酶结合物制备、标准等系统性研究数据等。质量研究报告方面，ELISA抗体检测方法建立研究报告中未采用已知非洲猪瘟病毒阳性血清进行相关研究。
4.1 一般建议 一是关于ASFV阳性样品。如用到ASFV阳性样品，应说明是否为灭活样品。如未灭活，应说明是否符合生物安全相关要求。购自中监所、非洲猪瘟参考/专业/区域实验室以及军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所的样品予以认可，可不提供制备研究报告，但需提供标准及购买证明。如为馈赠，也需提供标准及馈赠单位证明。二是质量标准敏感性检验标准应明确检测范围。敏感性质控品含量如为定值，敏感性检验暂不要求必须检到阴性；
敏感性质控品含量如非定值，敏感性检验应检到阴性。三是作用与用途中涉及的样品类型均需有研究数据支持。四是申报资料应提供具体试验数据，包括电泳图、ELISA检测OD值等。五是敏感性质控品和特异性质控品应采用本试剂盒之外的方法检验。六是敏感性研究报告中应包括临床阳性样品的研究数据。七是特异性研究报告中应包括临床样品的研究数据。八是保存期研究报告应提供制品达到规定保存期并延长3个月的研究数据。九是临床试验研究报告所用临床样品中应包括阴性样品、阳性样品；
针对非洲猪瘟诊断制品，暂不要求阳性样品比例达到10%。
4.2 分子生物学检测试剂盒建议 一般情况下，可以使用质粒作为质控品。多重荧光PCR检测试剂盒应提供多重荧光与单荧光检测敏感性比较研究报告。如有冻干组分，应提供冻干工艺研究报告。
4.3 免疫学检测试剂盒建议 一是抗体检测类的制品，一般应使用全病毒阳性血清作为质控品。二是重组抗原应采用非洲猪瘟病毒阳性血清进行特异性鉴定。三是抗体检测试剂盒特异性质控品除阴性样品外，一般应包括出现交叉/干扰反应的其它血清及生产包被抗原时所用细胞、表达载体、标签蛋白等的阳性血清。四是应提供单抗特异性鉴定、酶标抗体活性、酶标抗原质量控制等研究资料。五是抗体检测试剂盒ELISA方法建立研究报告中应采用已知非洲猪瘟病毒阳性血清进行相关研究，临界值确定所用血清应采用经典方法进行确认。
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