摘 要：利用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）技术，建立了蔬菜中38种农药残留的检测方法。样品以乙腈为提取溶剂，高速匀浆提取，氯化钠脱水，高速离心分层，提取液经氨基固相萃取小柱净化，利用HPLC-MS/MS进行测定。结果表明：38种农药在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数为0.975～0.999；其中，豇豆和辣椒样品在0.01 mg/kg添加水平下回收率分别为72.6%～119.6%和76.5%～118.2%，在0.10 mg/kg添加水平下回收率分别为71.5%～119.4%和75.5%～119.2%，相对标准偏差均在10%以内；该方法的定量下限为0.002 mg/kg。经验证，该方法具有灵敏度高、选择性好、回收率高且穩定等优点，用于实际蔬菜样品中农药残留的测定，结果较为满意。
关键词：蔬菜；农残检测；高效液相色谱串联质谱
中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2018）06-0091-05
Simultaneous Determination of 38 Pesticide Residues in Vegetables by HPLC-MS/MS Method
ZHANG Wei-jun
（Liuyang Agricultural Product Quality Monitoring Center， Changsha 410300， PRC）
Abstract： Thirty and eight pesticide residues in vegetables were detected simultaneously by Hplc-MS/MS. Using acetonitrile as extraction solvent， the sample was first extracted with high speed homogenate， then dehydrated with NaCl and stratified by high speed centrifugation， the extraction liquid was purified by amino-solid extraction column and determinate by HPLC-MS /MS. The results showed that 38 kings of pesticides have good linearity within a certain mass concentration range， and the correlation coefficient is 0.975-0.999. The recovery rates of cowpea and pepper samples were 72.6%-119.6% and 76.5%-118.2% respectively， at the addition level of 0.01 mg/kg； the recovery rates were 71.5%-119.4% and 75.5%-119.2% respectively， at the addition level of 0.10 mg /kg. The relative standard deviation was within 10%. The quantitative lower limit of this method is 0.002 mg/kg. In conclusion， HPLC-MS/MS has the advantages of high sensitivity， good selectivity， high recovery and stability， and can be used for determination of pesticide residues in real vegetable samples.
Key words： vegetable； detection of pesticide residue； HPLC-MS/MS
蔬菜是人们日常生活中必不可少食物之一，为了缩短蔬菜的生长期、提高产量并减少病虫害的影响，各类化肥和农药广泛使用，对蔬菜造成不同程度的污染。近年来，随着各国对食品安全问题的重视，蔬菜中的农药残留检测要求越来越严格，我国农业部对蔬菜农药残留例行监测的种类多达58种[1-5]。要完成这58种农药残留检测，按照传统色谱技术至少需要气相色谱仪和液相色谱仪，并且配置4个不同的检测器。近年来，色谱-质谱联用技术作为多农药残留的检测手段越来越受到人们的青睐。尤其是HPLC-MS/MS技术，HPLC可以实现多种农药快速分离，串联质谱可以对目标农药准确定性，并提高检测灵敏度，三重四级杆质谱检测器在多反应监测模式（MRM）下具有更好的检测灵敏度和选择性，大大降低了假阳性分析结果的概率，非常适合蔬菜中低含量多农药残留物的分析[6-9]。豇豆和辣椒是湖南省种植较多的蔬菜品种，也是农药使用量较大、容易出现农药残留超标的蔬菜品种，笔者以辣椒、豇豆等10种蔬菜为研究样品，建立了甲胺磷、乙酰甲胺磷等38 种农药的HPLC-MS/MS 检测方法，对仪器条件、前处理方法进行了比较研究。结果表明该方法准确可靠，可用于蔬菜农药的快速检测分析。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
试验主要仪器有高效液相色谱—三重四级杆串联质谱仪（e2695-TQD，ESI源） 和 XBridgeBEH C18柱[100 mm × 2.1 mm×2.7μm，美国Waters公司）、氮吹仪（美国 Organomation公司）、均质机（T18，德国 IKA 公司）、超纯水纯化系统（milli-Q reference，Millipore公司）、C18氨基固相萃取柱（3 cc，500 mg， 美国waters公司）、针式过滤器（0.22 μm，PTFE，天津德祥）、高速离心机（湖南湘仪）、搅拌器（珠海飞利蒲电器公司）、旋转蒸发仪（上海申生仪器厂）。
试验主要试剂有甲醇、乙腈、甲苯（色谱纯，Merck公司）；超纯水；甲酸（96%）、 乙酸铵（均为德国CNW公司产品）；氯化钠（分析纯，140 ℃烘干4 h）。38种农药标准品（中国农业部环境监测所）。
待测蔬菜样品来源于5家蔬菜生产单位，采集了黄瓜、普通白菜、番茄、茄子、辣椒、结球白菜、莴笋、叶芥菜、菜薹、甘薯叶等10种蔬菜样品。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配制 （1）标准储备液：准确量取各标准溶液0.5 mL于 50 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂配成10 mg/L的混合标准储备溶液，冷藏避光保存。（2）标准工作液的配制：分别按量量取标准储备液，用空白基质液（V甲醇∶V水=2∶8）稀释，得到系列标准混合工作液，质量浓度分别为 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L，外标法定量。
1.2.2 待测蔬菜样品的前处理 （1）提取：将蔬菜可食部分用搅拌机打碎，取15.00 g（精确至0.01g）于100 mL聚四氟乙烯离心管中，加入30 mL乙腈，高速匀浆1 min；采用无水硫酸钠和氯化钠作为脱水剂，用量均为5 g，比较二者的脱水效果再确定最适脱水剂；继续高速匀浆1 min，4 000 r/min高速离心4 min，取上清液待净化。（2）净化：比较了Carbon/NH2、NH2、C18氨基固相萃取柱对豇豆基质的净化效果，具体操作如下，用6.0 mL淋洗剂（V乙腈∶V甲苯
=3∶1）预淋洗，待固相萃取小柱平衡好后置于10 mL 鸡心瓶上，加入1 mL提取液，当提取液完全降至填料面时加入3 mL淋洗剂进行洗脱，收集洗脱液，在4 0℃水浴下减压旋转蒸发浓缩至约0.2 mL，再转为40℃氮气吹干，立即用1.0 mL 甲醇溶液（V甲醇∶V水
=2∶8）溶解定容， 过0.22 μm滤膜，待HPLC- MS /MS测定。
1.2.3 HPLC 检测条件 试验采用乙腈+水、甲醇+水和甲醇+水+10 mmol乙酸铵+1%甲酸水溶液3种流动相对目标化合物进行分离，色谱柱为XBridgeBEH C18柱，试液定容溶剂为V甲醇︰V水=2︰8溶剂体系，进样体积5 μL。
1.2.4 质谱检测条件 采用直接进样的方式手动调节各质谱参数。离子源为电喷雾离子（ESI）源，温度120℃；毛细管电压3.0 kV；去溶剂温度350℃；去溶剂气流量750 L/h；锥孔气流速100 L/h；锥孔电压30 V；采用MRM多反应离子监测模式；其余质谱条件见
表1。
1.2.5 检测方法的验证及蔬菜样品的检测 将质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的混合标准基质溶液進样分析，以各组分的进样质量浓度（x，μg/L） 和峰面积（Y） 绘制标准曲线。在优化的HPLC-MS/MS条件下，对38种农药的线性范围、定量下线进行检测。并在豇豆和辣椒样品中添加0.01和0.10 mg/kg的各种农药，上样检测，计算添加回收率（n=3），并验证检测方法的精密度。采用试验建立的方法对蔬菜样品进行处理和检测。
2 结果与分析
2.1 样品提取优化
2.1.1 脱水剂 蔬菜含水量普遍偏高，38种农药中有多种水溶性强的农药。无水硫酸钠通过与水结合的方式脱水，易受潮变性。试验结果表明，采用无水硫酸钠脱水，常出现甲胺磷和乙酰甲胺磷等水溶性强的农药回收率低、乙腈提取液脱水不完全、过氨基固相萃取柱堵塞等现象；而氯化钠是以饱和溶解方式脱水，其作为脱水剂时不会出现上述现象。故最终选择氯化钠作为脱水剂。
2.1.2 净化柱 直接往预淋洗好的固相萃取柱添加标准工作液，比较了Carbon/NH2、NH2、C18氨基固相萃取柱的对38种农药的滤过性，结果如图1所示。虽然Carbon/NH2净化效果最好，但对多种农药吸附较强，故最终确定采用C18氨基固相萃取柱作净化柱，淋洗液为乙腈和甲苯的混合液（V乙腈∶V甲苯 =3∶1）。
2.2 流动相优化
试验结果显示，以甲醇为有机相时，各组分的信号强度比较稳定；而以乙腈为有机相时信号明显降低，且强极性农药如甲胺磷的保留时间过短，峰形较差；故甲醇为流动有机相更合适。而在甲醇+水的流动相中加入一定量的乙酸铵和甲酸等缓冲盐各成分的分离效果更好。这是因为甲酸对氨基甲酸酯类农药的正离子化有增强效果，而乙酸铵对负离子化有增强效果，而且会明显抑制部分农药的正离子化。多菌灵保留时间受pH值影响较大，pH值越小，保留时间越短。为确保38种农药在质谱上都有较好的响应，试验最终采用甲醇+水+10 mmol乙酸铵+1%甲酸水溶液作为流动相进行三元梯度洗脱分离，流动相参数见表2。虽然降低了部分有较高正离子化的农药的响应值，但确保了所有农药均有较好的离子化，同时保证了多菌灵等保留时间易受基质pH值影响的农药的稳定性。
2.3 方法的线性范围与定量下限、回收率与精密度
如表3所示，在优化的HPLC-MS/MS条件下，38种农药标准溶液在上述质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数R2为0.975～0.999。按照S/N≥10的标准，该方法对38种农药的最低检测限均为0.002 mg/kg，满足GB2763—2016中最大残留限量要求。在豇豆和辣椒中分别添加0.01和0.10 mg/kg的各种农药，豇豆在0.01 mg/kg添加水平下的回收率为72.6%～119.6%，在0.10 mg/kg添加水平下的回收率为71.5%～119.4%；辣椒在0.01 mg/kg添加水平下的回收率为76.5%～118.2%，在0.10 mg/kg添加水平下的回收率为75.5%～119.2%；RSD均在10%以内。
2.4 蔬菜样品的检测
从表4中可以看出，以结球白菜和莴笋为例，在1 kg结球白菜样品中含吡虫啉0.1mg，符合GB/J2763的限量标准，属于合格蔬菜；而1 kg莴笋样品中检出克百威含量为0.050 mg，超出了GB/J2763中规定的限量标准（0.02 mg），属于农残超标蔬菜。
3 结论与讨论
传统HPLC检测器一般搭配UV检测器或者FLR检测器，检测器流通量大，对流动相流速兼容性高，因此一般HPLC使用直径较大、填料颗粒粒径加大的色谱柱。但是当HPLC使用质谱做检测器时，由于离子源采用ESI源，最适液相流速不能高于0.8 mL/min。当使用0.8 mL/min流速，在传统液相色谱柱下，检测各农药化合物峰底宽均超过1 min，且质谱受高流速液相影响，离子化效率降低，仪器灵敏度降低。试验采用XBridgeBEH C18柱作色谱柱，在0.25 mL/min流速下，依然有较好的柱效和分析时间。但由于溶剂效应，试液采用甲醇为溶剂时，极性强的农药（如甲胺磷、乙酰甲胺磷、涕灭威砜等）保留时间过短，峰形差，易受基质干扰。为消除溶剂效应，试验选择甲醇和水作为定容溶剂体系，V甲醇︰V水=2︰8，进样体积从10 μL降至5 μL。
在选择质谱条件参数时，为了获得最佳的灵敏度和分离效果，采用直接进样的方式 手动调节各质谱参数。结果显示，大部分农药电喷雾离子化正离子扫描模式可得到较好的电离效果，并获得特征离子峰[M+H]或[M+Na]，少部分为[M-H]。故在此基础上进一步选择质谱参数合适的监测离子锥孔电压及碰撞能量。
研究从农业部蔬菜农药残留例行监测参数出发，结合本地蔬菜生菜实际情况，选取了38种农药残留做为研究对象，以豇豆和辣椒为试验样本，采用高效液相串联三重四级杆质谱（HPLC-MS/MS）作为检测设备，建立的较国标方法（GB/T20769—2008）更为简便的前处理方法，精简了一次预浓缩操作，优化了脱水剂的种类。试验结果证明该方法准确可靠，能够满足蔬菜中多种农药残留的检测分析。
參考文献：
[1] GB/T20769—2008. 水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].
[2] NY/T1679—2009. 植物性食品中氨基甲酸酯类农药残留的测定液相色谱-串联质谱法[S].
[3] GB/T23205—2008. 茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].
[4] GB/T20770—2008. 粮谷中486种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].
[5] GB/T23206—2008. 果蔬汁、果酒中512种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].
[6] 王 敏. 固相萃取技术和高效液相色谱串联质谱联用在茶叶中农药残留检测中的应用[D]. 合肥：安徽大学，2013.
[7] 郭景春，李 娜，王建忠. 超高效液相色谱-串联质谱法快速测定8种蔬菜中114种农药残留[J]. 质谱学报，2014，（3）：279-288.
[8] 陈爱松，崔银仓，羌 松，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定哈密瓜和茄子中氟啶虫胺腈的残留量[J]. 食品工业科技，2017，38（20）：260-265.
[9] Tian C Y，Xu J，Dong F，et al. Determination of sulfoxaflor in animal origin foods using dispersive solid—phase extraction and multiplug filtration cleanup method based on multiwalled carbon nanotubes by ultraperformance liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016，64（12）：2641-2646.
（责任编辑：成 平）