摘 要 哈茨木霉是一种重要的蔬菜病害生防真菌，其对蔬菜病害致病菌具有拮抗作用，可以抑制病原菌的生长。基于此，通过离体抑菌实验探究哈茨木霉对黑斑病、灰霉病、细菌性软腐病3种常见蔬菜病害的生防效果。通过生长抑制率及有效中浓度（EC50）的测定发现：哈茨木霉制剂对灰霉病、黑斑病致病菌抑制效果显著，在高浓度下生长抑制率分别为95.38%和88.62%，对灰霉病的EC50为3.28 g·L-1，对黑斑病的EC50为10.03 g·L-1，但其对细菌性软腐病抑制效果不明显，最高生长抑制率仅为45.39%，EC50为596.07 g·L-1。
关键词 哈茨木霉；灰霉病；黑斑病；细菌性软腐病
中图分类号：S476 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.070
采后蔬菜易受到生理性病害和病理性病害的影响，在贮运过程中损耗率可达40%～50%，其中病理性腐敗是蔬菜采后损耗的主要因素[1]。蔬菜采后病害种类繁多，其中灰霉病、黑斑病和细菌性软腐病是较为常见病害。黑斑病易侵染西兰花、白菜、甘蓝等蔬菜，其致病菌是芸苔链格孢菌[2]；灰霉病致病菌为灰葡萄孢菌[3]，西红柿、菜豆等蔬菜比较容易感染该病；细菌性软腐病致病菌为胡萝卜软腐病坚固杆菌，多发生在白菜、青椒、生菜、洋葱等蔬菜中[4-5]。
目前，对于蔬菜采后病害的有效防治手段有化学抑菌剂和低温保藏。低温保藏技术虽然有效，但我国蔬菜冷链运输覆盖率低且运输成本高，难以全面推广使用[6]。
化学抑菌剂对蔬菜病害防治效果优良，但存在健康危害、诱导耐药致病菌等危害，其使用受到严格限制[7]。利用更加安全的生物防治手段，可以在保障食品安全的前提下进行蔬菜采后病害防治。哈茨木霉（Trichodcrma harzianum）是目前研究最为深入的一种生防真菌，对病原菌抑制具有广谱性[8]。本文主要研究了哈茨木霉对黑斑病、灰霉病、细菌性软腐病的防治效果，为哈茨木霉在采后蔬菜贮运过程中的使用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
芸苔链格孢菌（Alternaria brassicicola）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、胡萝卜软腐病坚固杆菌（Pectobacterium carotovorum），由中国科学院微生物研究所分离；哈茨木霉（Trichodcrma harzianum），购自美国拜沃股份有限公司；PDA培养基、营养肉汁琼脂，青岛海博生物技术有限公司。
MJX-100B-Z型霉菌培养箱、SPX-100B-Z型生化培养箱、YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），SW-CJ系列净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司），XH-C漩涡混合器（金坛市白塔新宝仪器厂），FA1004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），B2O3LED显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司），血球计数板等。
1.2 实验方法
1.2.1 孢子（菌）液的制备
分别向活化后的芸苔链格孢菌、灰葡萄孢菌、胡萝卜软腐病坚固杆菌斜面中加入10 mL无菌水，刮取斜面孢子或菌苔，振荡60 s混匀，经两层纱布过滤后，调整孢子液浓度为106个/mL，菌液浓度为108个/mL。
1.2.2 菌饼的制备
取上述制备的孢子液100 μL涂布到PDA培养基上，于28 ℃培养2～3 d，用打孔器打取直径为6.80 mm的菌饼。取上述制备的菌悬液10 μL涂布到营养肉汁琼脂上，于30℃培养24 h，用打孔器打取直径为6.80 mm的菌饼。
1.2.3 哈茨木霉的防治效果研究
1）对黑斑病的防治效果。配制浓度为280 g·L-1、140 g·L-1、70 g·L-1、35g·L-1、17.5 g·L-1、8.75 g·L-1、4.375g·L-1的哈茨木霉悬液，各取100 μL涂布于PDA培养基上，静置10 min。将芸苔链格孢菌菌饼，有菌面朝下接种在培养基上，于28 ℃下培养7 d，用十字交叉法测量芸苔链格孢菌菌落直径。
2）对灰霉病的防治效果。配制浓度为80 g·L-1、40 g·L-1、20 g·L-1、10 g·L-1、5 g·L-1、2.5 g·L-1、1.25 g·L-1L、0.625 g·L-1的哈茨木霉悬液，各取100 μL涂布于PDA培养基上，静置10 min。将灰葡萄孢菌菌饼，有菌面朝下接种在培养基上，于28 ℃下培养7 d，用十字交叉法测量灰葡萄孢菌菌落直径。
3）对细菌性软腐病的防治效果。配制浓度为280 g·L-1、140 g·L-1、70 g·L-1、35 g·L-1、17.5 g·L-1、8.75 g·L-1、4.375 g·L-1的哈茨木霉悬液，各取100 μL涂布于营养肉汁培养基上，静置10 min。将胡萝卜软腐病坚固杆菌菌饼，有菌面朝下接种在培养基上，于30 ℃下培养24 h，用十字交叉法测量胡萝卜软腐病坚固杆菌菌落直径。
1.3 数据处理
1.3.1 生长抑制率的计算[9]
根据以下公式计算出不同浓度的哈茨木霉制剂对芸苔链格孢菌、灰葡萄孢菌、胡萝卜软腐病坚固杆菌的生长抑制率。
1.3.2 有效中浓度（EC50）的计算[10]
以哈茨木霉浓度的对数值为X轴，不同致病菌的抑制率为Y轴，获得毒力回归方程，分别计算哈茨木霉对黑斑病、灰霉病、软腐病抑制有效中浓度（EC50）。
2 结果与分析
2.1 哈茨木霉对灰霉病防治效果
由图1可知，哈茨木霉浓度与其对灰霉病致病菌灰葡萄孢菌的抑菌能力呈正相关。在浓度低于10 g·L-1时，随浓度的增加，生长抑制率快速增长；当哈茨木霉浓度高于10 g·L-1时，生长抑制率持续增长但是趋势变缓。在浓度为80 g·L-1时，哈茨木霉制剂对灰葡萄孢菌的生长抑制率为95.38%，表现出对灰葡萄孢菌的显著抑菌效果。
2.2 哈茨木霉对黑斑病防治效果
由图2可知，随着哈茨木霉浓度提高，其对芸苔链格孢菌抑菌作用越显著。当浓度高于20 g·L-1时，生长抑制率增长趋势变缓，在浓度为280 g·L-1时，哈茨木霉制剂对灰葡萄孢菌的最高生长抑制率为88.62%，哈茨木霉能有效抑制芸苔链格孢菌的生长，对黑斑病有明显防治效果。
2.3 哈茨木霉对细菌性软腐病防治效果
由图3可知，哈茨木霉制剂对胡萝卜软腐病坚固杆菌的抑菌率随浓度增大而稳定提高。当哈茨木霉制剂浓度最高为280 g·L-1时，哈茨木霉制剂对胡萝卜软腐病坚固杆菌的菌丝生长抑制率仅为45.39%。哈茨木霉制剂对胡萝卜软腐病坚固杆菌的整体抑菌效果不显著，不能有效防止细菌性软腐病的发生。
2.4 哈茨木霉对三种致病菌的有效中浓度
由表1可见，哈茨木霉浓度的对数值（X）与灰葡萄孢菌、芸苔链格孢菌、胡萝卜软腐病坚固杆菌生长抑制率（Y）之间的线性相关性良好，相关系数均在0.93以上。根据哈茨木霉对3种致病菌的毒力回归方程，可算出哈茨木霉对灰葡萄孢菌、芸苔链格孢菌、胡萝卜软腐病坚固杆菌的EC50值为3.277 9 g·L-1<10.032 3 g·L-1<596.073 6 g·L-1。由EC50值可知，哈茨木霉制剂对灰霉病的抑制效果非常显著，对黑斑病抑制效果次之，对细菌性软腐病的抑制效果较差。
3 结语
哈茨木霉可通过营养竞争、抗生、重寄生与病害致病菌发生拮抗作用。此外，研究人员发现，其还能产生乙醛、吡喃酮、木霉素等对真菌性病害有抑制作用的分泌物[11-12]，因此对于真菌性病害防治效果更为显著。赖建等以哈茨木霉发酵液对浸泡处理新鲜茄子，在温度20～25 ℃，湿度90%～94%条件下贮藏，观察计算贮藏期茄子的好果率、发病率和腐烂率，研究发现贮藏20 d后，茄子发病率仅为6%～13%，远低于未处理的对照组，其对茄子的保鲜效果与多菌灵甲基托布津混合液的保鲜效果相当[13]。
本次实验发现，哈茨木霉在浓度为80 g·L-1时，可有效抑制灰葡萄孢菌，生长抑制率为95.38%；当浓度为280 g·L-1时可有效抑制芸苔链格孢菌，生长抑制率为88.62%；但即使是在最高浓度下对胡萝卜软腐病坚固杆菌生长抑制率仅为45.39%。哈茨木霉对灰霉病和黑斑病有效中浓度（3.277 9 g·L-1和10.03 g·L-1）显著低于细菌性软腐病（596.073 8 g·L-1），其对于灰霉病、黑斑病防治具有实际使用价值，但不适用于细菌性软腐病的单独防治。
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（责任编辑：赵中正）