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摘要：目的 研究非创伤性股骨头坏死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）高发体质类型血瘀质与ApoA1位点多态性的相关性。方法 选择93例NONFH患者作为病例组，随机选取无血缘关系健康志愿者83例作为对照组。对病例组进行中医体质问卷调查，将NONFH患者分为血瘀质32例、非血瘀质61例。受试者取血样2 mL，提取DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行DNA测序，检测PAF-AH G994T、NOS1基因rs9658282位点多态性，进行统计学分析。结果 ApoA1基因-75G/A位点AA基因型（OR：2.578；95%CI：1.174-5.663；P=0.018）与A等位基因（OR：1.726；95%CI：1.121-2.658；P=0.013）可能是NONFH发病的危险因素之一。结论 ApoA1基因-75G/A可能与NONFH发病相关。ApoA1基因-75G/A位点基因多态性与血瘀质NONFH发病无相关性，ApoA1基因+83C/T位点基因多态性与血瘀质NONFH发病无相关性。
关键词：非创伤性股骨头坏死；ApoA1基因-75bp/+83bp位点；中医体质；血瘀质
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.005
中图分类号：R272.968.3 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0017-05
Abstract： Objective To study the correlation between nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH） and ApoA1 polymorphism of blood stasis type. Methods Totally 93 cases of NONFH were selected as the case group， and 83 healthy volunteers were randomly selected as the control group. With TCM constitution questionnaire survey， the case group was screened out 32 cases of blood stasis NONFH type and 61 cases of non blood stasis NONFH type. In the case group and control group， the subjects took blood samples 2 mL， extracted DNA for PCR amplification， PCR products for DNA sequencing. G994T PAF-AH and rs9658282 gene NOS1 site polymorphism were detected for tatistical analysis. Results -75G/A gene AA ApoA1 genotype （OR： 2.578； 95%CI： 1.174-5.663； P=0.018） and A allele （OR： 1.726； 95%CI： 1.121-2.658； P=0.013） may be one of the risk factors of NONFH. Conclusion -75G/A gene ApoA1 may be related to the pathogenesis of NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of -75G/A gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of +83C/T gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH.
Key words： nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH）； ApoA1 gene-75bp/+83bp point； TCM constitutions； blood stasis
非创伤性股骨头坏死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）发病机制目前尚不完全清楚，其治疗有一定的盲目性和经验性。对其病因分子生物学机制及药物防治早期NONFH的研究是当今骨科研究热点之一。中医药防治NONFH显示出了一定的优势，主要体现在中医辨证论治的治疗原则重视对个体体质状态的辨析，在治疗过程中发挥“因人制宜”的防治思想。本课题组前期研究显示，血瘀质是NONFH的高发体质类型之一。本研究通过检测血瘀质NONFH患者ApoA1基因多态性，探讨中医血瘀体质与NONFH的相关性，为通过体质辨别运用中医药干预NONFH提供新的思路和依据。
1 资料与方法
1.1 病例选择标准
NONFH诊断、纳入及排除标准依据2006年中华医学会骨科学分会关节外科学组提出的《股骨头坏死诊断与治疗的专家建议》[1]及《中药新药临床研究指导原则》[2]制定。
1.2 中医体质判定标准
依据《中医体质分类与判定》[3]制订“非创伤性股骨头坏死中医体质类型及相关基因多态性研究”调查表，中医体质分为平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、血瘀质、气郁质、特禀质9种类型。
1.3 一般资料
应用临床流行病学方法，于2011年1月-2013年8月在甘肃省中医院骨科门诊、住院部对NONFH患者及非血缘关系健康志愿者进行问卷调查，以NONFH患者作为病例组，无血缘关系健康志愿者为对照组。病例组93例，其中血瘀质32例，非血瘀质61例；对照组83例，与病例组在居住地分布上基本一致。2组性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），体质指数比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。本研究方法经本院伦理委员会讨论并批准。受试者均签订知情同意书。
1.4 病例调查与样本采集
对调查者进行相关理论知识、调查方法及实验方法培训。因NONFH分布不集中，故指定专职调查者进行病例的收集，并采取空腹外周血2 mL，置入装有EDTA抗凝剂的无菌管中，混匀，-80 ℃冰箱保存。
1.5 试验材料
TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），Premix Ex Taq Version2.0，TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。引物1（10 µmol/L）、引物2（10 µmol/L），TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。QuickCutTM MspI限制性内切酶试剂盒，TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。灭菌蒸馏水，兰州军区总医院水处理系统，高压灭菌。
1.6 试验方法
1.6.1 DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）自血液中提取DNA。
1.6.2 PCR扩增 ApoA1基因-75bp/+83bp位点引物序列：上游5"-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACT CTTAAG-3，下游5"-TTAGGGGACACCTAGCCCTCA GGAAGAGCA-3，扩增片段长度433 bp。PCR反应体系：Premix Ex Taq 25 µL，上游引物（10 µmol/L）2 µL，下游引物（10 µmol/L）2 µL，模板DNA 4 µL，灭菌三蒸水17 µL，总体积50 µL。将上述体系加入0.5 mL Eppendorf离心管后瞬时离心，防止体系内液体附壁。ApoA1基因-75bp/+83bp位点的PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃延伸7 min；保存温度4 ℃。琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳验证，结果见图1。
1.6.3 PCR扩增产物的酶切 ApoA1基因-75bp、+83bp位点的PCR扩增产物在快速酶切反应体系中37 ℃温浴30 min。①ApoA1基因-75bp位点酶切产物检测：配制1.5%琼脂糖凝胶。取5 µL DL500 DNA Marker加入1.5%琼脂糖凝胶第一个样品槽中；因10×QuickCut Green Buffer中含有电泳时所必需的色素等试剂，酶切产物可直接进行电泳检测，取6 µL酶切产物依次按标记序号直接加样于琼脂糖凝胶板其他样品槽中，电泳槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。设定电压为125 V，电流保持在80 mA以上进行电泳分离。20 min后，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2 cm，DL500 DNA Marker条带散开可辨时停止电泳。电泳结果使用YLNCCAP OF OLP凝胶成像系统进行观察并拍照。ApoA1基因-75bp位点G被A取代，MspI酶切位点丢失，-75bp处由于碱基的变异而形成GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）和AA（179bp片段）3种等位基因型。②ApoA1基因+83bp位点酶切产物检测：方法同上。ApoA1基因+83bp处C被T取代后，MspI酶切位点丢失，+83bp处的碱基变异形成CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp片段）、TT（254bp片段）或GG、GA、AA 3种等位基因型。
1.7 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。首先通过χ2检验分析总体上各基因型及等位基因分布差异（P<0.05表示差异有统计学意义），基因型分布符合Hardy- Weinberg遗传平衡定律，其次通过多项logitic分析找到具有显著差异（P<0.05）的基因型或等位基因。
2 结果
2.1 基因检测及分型结果
176例样品中，MspI酶切共检测出6种基因型：GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）、AA（179bp片段）、CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp）、TT（254bp片段）。结果见图2。
2.2 ApoA1基因-75G/A位点多态性与血瘀质非创伤性股骨头坏死的关系
ApoA1基因-75G/A位点病例组与对照组总体上各基因型及等位基因分布差异有统计学意义（χ2=7.391，P<0.05；χ2=6.183，P<0.05），病例组AA基因型的发病风险是GG基因型的2.578倍，A等位基因的发病风险是G等位基因的1.726倍，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。提示ApoA1基因-75G/A的突变使NONFH的发病风险增高。
将病例组血瘀质、非血瘀质与对照组两两比较，其中血瘀质与对照组总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=5.434，P>0.05；χ2=2.657，P>0.05），非血瘀质与对照组总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=5.848，P>0.05；χ2=2.377，P>0.05），血瘀质与非血瘀质总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=0.664，P>0.05；χ2=0.100，P>0.05），见表3。提示ApoA1基因-75G/A位点多态性与血瘀质高发NONFH不具有相关性。
2.3 ApoA1基因+83C/T位点多态性与血瘀质非创伤性股骨头坏死的关系
ApoA1基因+83C/T位点病例组与对照组总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=1.168，P>0.05；χ2=0.650，P>0.05），见表4。提示ApoA1基因+83C/T位点基因多态性与NONFH发病无相关性。
将病例组血瘀质、非血瘀质与对照组两两比较，其中血瘀质与对照组总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=0.353，P>0.05；χ2=0.345，P>0.05），非血瘀质与对照组总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=1.138，P>0.05；χ2=0.504，P>0.05），血瘀质与非血瘀质总体上各基因型及等位基因分布差异无统计学意义（χ2=0.141，P>0.05；χ2=0.000，P>0.05），见表5。提示ApoA1基因+83C/T位点多态性与血瘀质高发NONFH不具有相关性。
3 讨论
我们前期研究结果显示，NONFH的病因病机以过量摄入激素类药物及酒精中毒引起脂代谢紊乱为主[4]，脂代谢紊乱是NONFH发病的重要机制之一，血脂的异常升高可引起一系列的血管病变，如血管栓塞（脂肪滴随血流流经较细的股骨头微小动脉时，形成栓塞，阻断微循环血供）[5]、血管损伤（血液中游离脂肪酸增多造成微血管内皮细胞功能障碍，主要包括活性氧的产生、凋亡的诱导以及内皮细胞依赖性血管舒张功能的异常）[6]、血管修复功能异常（游离脂肪酸破坏血管内皮细胞增值与凋亡的平衡，导致血管修复功能减弱），以及凝血异常（游离脂肪酸引起促凝血状态，纤维溶解活性降低，血小板的活性和功能增强）。由此可见，脂代谢紊乱引起血脂增高是NONFH血管病变的重要因素。ApoA1作为构成高密度脂蛋白的重要载脂蛋白，是脂质代谢过程的关键调节因子。如果ApoA1的结构或表达量发生变化，则可引起血脂代谢的紊乱，导致血中脂肪酸含量异常，进一步引起上述的血管病变。ApoA1基因结构的改变影响着ApoA1的分子结构、生成和向血液中释放的速率，进而影响血中ApoA1与HDL的水平。本研究选取ApoA1 -75G/A和+83C/T多态性位点，以血瘀质NONFH患者为研究对象，并将血瘀质NONFH、非血瘀质NONFH及对照组进行两两比较，探讨血瘀质高发NONFH与ApoA1 -75G/A和+83C/T的相关性。结果表明，AA基因型及A等位基因可能是发生NONFH的分子生物学机制之一。但并未发现血瘀质NONFH与ApoA1 -75G/A和+83C/T具有相关性。
ApoA1-75G/A多态性不仅可以破坏MspI内切酶识别位点，还能够改变GGGCCGG序列，后者是ApoA1基因转录的调控元件，具有激活转录的作用。当该序列发生变化时，可能会影响基因的转录和表达，从而影响ApoA1的合成。早期报道显示，ApoA1基因启动子-75bp A等位基因与血浆ApoA1和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平密切相关，并认为是A碱基的置换促进了ApoA1基因的表达及合成[7]。本研究发现，A等位基因分布频率低可能与NONFH的发病相关。说明ApoA1表达量过低可能与本病的发生相关。如ApoA1的表达及合成减少，首先影响血浆中脂类的传输，其次影响激活卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶（LCAT），阻碍成熟HDL的形成，从而增加肝外组织细胞及血浆中脂类的沉积，进一步使血脂升高并引起血管病变。主要可导致血管内皮细胞凋亡，内皮依赖性舒张功能下降并形成高凝血、低纤溶的病理状态，脂质过氧化形成xo-LDL沉积于血管局部，参与脂质斑块的形成，最终阻塞微血管，血管局部氧化性损伤及舒张性降低可阻断微血管血流，是微循环障碍的重要因素。而这些血管病变有可能是股骨头局部血运障碍的主要因素，这与本课题组前期研究NONFH发病的重要机制“脂代谢紊乱-血管病变”一致。本研究结果亦显示，ApoA1-75G/A位点及A等位基因与NONFH相关。所以推断ApoA1基因-75G/A位点A等位基因可能与NONFH发病具有相关性。也有报道显示，ApoA1的生成率在GG纯合子中显著高于GA杂合子，同时体外观察发现A等位基因伴有启动子活性降低，并且表达水平降低[8]。本研究未发现GG、GA基因型与NONFH具有相关性。而A等位基因对ApoA1表达的影响，本课题组会在后续试验中进一步研究，并扩充样本量，探讨NONFH高发体质类型的分子生物学机制。
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