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摘要：以GR891木薯胚性愈伤组织为材料，常规保存（GD培养基+12.0 mg/L毒莠定+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂）培养基为对照（CK），研究处理培养基中添加不同浓度蔗糖（25、30、35、40 g/L）、甘露醇（20、30、40、50 g/L）和多效唑（4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）对木薯胚性愈伤组织保存40 d时超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性的影响。结果表明，在20 ℃条件下，处理组与对照组SOD、POD、CAT活性呈先升高后降低的趋势，甘露醇和多效唑处理比蔗糖处理的3种保护酶活性高，下降的速度也较缓慢。与对照相比，蔗糖和甘露醇浓度均为 30 g/L 胁迫时，SOD、POD、CAT活性同时出现峰值，且一直维持较高水平;随着多效唑浓度（4.0～8.0 mg/L）的升高，SOD、POD、CAT活性不断升高，多效唑浓度为8.0 mg/L时木薯胚性愈伤组织中3种保护酶活性最高。说明将木薯胚性愈伤组织保存在添加蔗糖或甘露醇30 g/L、多效唑8.0 mg/L的常规固体培养基上，可以有效地延长木薯胚性愈伤细胞寿命，延缓保存时细胞的衰老。
关键词：木薯;胚性愈伤组织;SOD;POD;CAT;蔗糖;甘露醇;多效唑
中图分类号： S533.01 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）20-0080-04
木薯是世界三大薯类作物（木薯、马铃薯、甘薯）之一[1]。传统的田间种植保存易受病虫害、自然灾害及经费短缺等弊端的困扰，这使得大量的木薯资源面临流失的可能。缓慢生长保存法是对木薯胚性愈伤组织进行离体种质保存的重要手段，其易于控制，且便于种质交流，需要时，能随时将保存材料大量繁殖[2]。缓慢生长保存是指通过添加渗透剂（蔗糖、甘露醇、山梨醇等）或生长抑制剂（比久、多效唑、烯效唑等）提高培养基的渗透压、改变植物生长培养条件来限制培养物生长，使植物组织因缺水而减弱新陈代谢，导致植物的细胞壁酶活性受到抑制，最终实现延缓生长的目的。
细胞内的保护酶系统主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等。SOD是清除活性氧反应过程中第1个发挥作用的抗氧化酶，且广泛参与植物体在各种逆境胁迫下的生理生化反应，对抗衰老和抗干旱都起到积极的作用[3]。POD是广泛存在于植物体内且功能较多的酶类，可清除活性氧，降低活性氧对细胞膜过氧化程度，减少膜脂过氧化，稳定膜系统[4]。CAT是植物体内的保护酶之一[5]，CAT和POD能作为愈伤组织生长过程中增殖和衰老的标志酶[6]。POD、CAT、SOD活性的变化与愈伤组织的生长及分化过程密切相关。有关植物胚性愈伤组织离体保存与细胞内保护酶系统活性变化的研究已有报道，黎金燕等的研究表明，培养基中附加1种抑制剂（DPI）可以促进尾叶桉胚性愈伤组织的诱导，从而提高POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性[7]。曾丽兰等研究发现，适当浓度的甘露醇和蔗糖，不仅可以有效提高植物细胞活力，而且还可以提高植物胚性愈伤组织中SOD活性[3-8]。刘怀攀等研究发现，在培养基中添加聚乙二醇（PEG）-6000和脱落酸（ABA）可以显著提高水生芦苇胚性愈伤组织中的CAT、POD活性[9]。叶炜等的研究表明，较高浓度的甘露醇处理可使胚性愈伤组织的SOD活性升高，考虑延缓衰老，均在培养基中加入20 g/L甘露醇以有效提高植物SOD活性[10-12]。目前，除黎萍等的报道[8]外，有关培养基成分与木薯胚性愈伤组织中的抗氧化酶活性之间的联系尚未见报道。为探讨SOD、POD、CAT活性与木薯胚性愈伤组织抗衰老之间的关系，研究在不同培养条件下保存40 d时木薯胚性愈伤组织中SOD、POD、CAT活性的变化，以期寻求一种更适合木薯离体种质的高效长期保存方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料
以广西亚热带作物研究所培育的木薯品种GR891为试验材料，对木薯嫩枝、侧芽进行水洗、灭菌，然后将其接种到MS+1.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L萘乙酸（NAA）+25.0 g/L蔗糖+6.5 g/L 琼脂的固体培养基上，培养45 d后获得木薯试管苗。对无菌试管苗的腋芽采用MS改良培养基（MS+2 mol/L CuSO4+12 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂）诱导胚性愈伤组织，然后用常规固体保存培养基（GD培养基+12.0 mg/L毒莠定+25.0 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂）进行增殖培养，获得继代胚性愈伤组织。以上培养基pH值均为5.8，培养条件为（20±1） ℃，光照度为1 000～1 200 lx，光照时间为 16～18 h/d。
1.1.2 试验仪器
JJ500型电子分析天平，购自常熟市双杰测试仪器厂;SW-CJ-1FD型超净工作台，购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;YZM-60B高压灭菌锅，购自广州豪尔生医疗设备有限公司;T6新世纪紫外分光光度计，购自北京普析通用仪器有限公司;YR11-2A磁力搅拌器，购自上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;LRH-400-G光照培养箱，购自韶关市泰宏医疗器械有限公司;CT15RT型高速冷冻离心机，购自上海天美生化仪器设备工程有限公司。
1.1.3 试剂
愈创木酚，由天津市光复精细化工研究所提供;氮蓝四唑，由合肥博美生物科技有限责任公司进口分装;核黄素，购自天津市大茂化学试剂厂;甲硫氨酸，由合肥博美生物科技有限责任公司进口分装;Na3-乙二胺四乙酸（EDTA），购自上海埃彼化学试剂有限公司;KH2PO4，购自天津市大茂化学试剂厂。
1.2 试验方法
1.2.1 培养条件对木薯胚性愈伤组织生长保存的影响
在GD培养基+12.0 mg/L毒莠定+6.5 g/L琼脂固体培养基中分别附加25、30、35、40 g/L蔗糖;在常规固体保存培养基上添加不同浓度甘露醇（20、30、40、50 g/L）和不同浓度的多效唑（4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）。选取继代3～5代生长良好的颗粒状木薯胚性愈伤，接种在上述培养基中，以不添加任何物质的常规培养基培养为对照（CK），每个处理接15皿，每培养皿接入胚性愈伤组织1 g，均放置在温度为20 ℃，光照度为 1 500～2 000 lx，光照时间为16 h/d的温室中培养，40 d后，分别测定SOD、POD、CAT活性的变化，每个处理重复3次。
1.2.2 测定方法
1.2.2.1 粗酶液的提取
称取愈伤组织材料0.5 g，加入7倍体积0.1 mol/L磷酸缓冲液（含1%聚乙烯吡咯烷酮，pH值7.0）和少量石英砂，置于冷冻好的研钵中研磨成匀浆，将匀浆液移入离心管中并低温抽提1 h，然后于4 ℃、15 000 r/min条件下离心 20 min。将上清液移至5 mL离心管中低温保存，并记录上清液的体积（V），所得的上清液即为含游离态SOD、POD、CAT的粗酶液。
1.2.2.2 SOD活性测定 SOD活性测定参考黎萍等的方法[8]并略加改进，所需的反应母液为0.05 mol/L pH值7.8磷酸缓冲液、130 mmol/L 甲硫氨酸（MET）溶液、750 μmol/L氮蓝四唑溶液、100 μmol/L EDTA-Na2溶液、20 μmol/L核黄素溶液，其中，将EDTA-Na2溶液和核黄素溶液合并在一起配制，当测定SOD活性时，将该混合液稀释100倍再使用。取3只对照管和1只样品管，添加一定量上述反应母液（磷酸缓冲液1.7 mL，MET溶液0.3 mL，氮蓝四唑溶液0.3 mL，EDTA-Na2溶液0.3 mL，核黄素溶液0.3 mL，酶液0.1 mL），然后往样品管中添加2.0 mL酶液，3只对照管添加1.0 mL提取缓冲液来代替酶液，反应体系的总量为3.0 mL。将1支对照管置于暗处，其余各管置于4 000 lx日光灯下反应 30 min，然后立即取出置于暗处终止反应。以避光管作为空白参比调零，分别测定其他各管在560 nm处的D值。以 1 min、1 g愈伤组织抑制NBT光化还原的50%来作为1个酶活性单位，用U/g表示，3次重复。
SOD活性=（Dc-Dt）×V/（0.5×Dc×Vt×m）。
式中：Dc为对照管吸光度;Dt为样品管吸光度;V为样品提取液总体积，mL;Vt为测定时样品用量，mL;m为愈伤组织鲜质量，g。
1.2.2.3 POD活性测定
过氧化物酶（POD）活性参考朱广廉等的方法[13]并略加改进，采用愈创木酚法测定，反应混合液由50 mL 0.05 mol/L pH值6.0磷酸缓冲液、19 μL 30% H2O2、28 μL愈创木酚（原试剂）混合而成，配制时先将磷酸缓冲液与愈创木酚混合加热溶解，冷却后再加入H2O2混匀即可。当进行POD测定时，先往一个测定管中添加反应混合液3 mL，以1 mL提取缓冲液代替酶液加入到该混合液中，混匀后作为空白对照调零。同样往另一测定管中添加反应混合液3 mL，加入1 mL酶液（事先已将其浓度稀释10倍），然后立即开启秒表计时，于 470 nm 条件下测D值，每隔30 s读1次数值，读数3 min，以1 min内D值变化作为1个POD活性单位，3次重复。
POD活性=（D470 nm×V×K）/（1×m×Vt×T）。
式中：K为稀释倍数;D470 nm为样品管吸光度;V为样品液总体积，mL;Vt为测定时样品用量，mL;m为愈伤组织鲜质量，g;T为光照反应时间，min。
1.2.2.4 CAT活性測定 过氧化氢酶（CAT）活性测定参照李玲等的方法[14]，酶促反应体系由2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液和100 μL酶提取液组成，以蒸馏水为参比空白，在反应15 s时开始记录反应体系在波长为240 nm处的吸光度，作为初始值，然后每隔 30 s 记录1次，连续测定6个点数据。以 1 g 木薯胚性愈伤组织（鲜质量）1 min吸光度变化值减少0.01为1个CAT活性单位，3次重复。
CAT活性=ΔD240 nm×V/（0.01×Vs×m）。
式中：ΔD240 nm为样品管吸光度变化量;V为样品提取液体积，mL;Vs为测定样品提取液体积，mL;m为愈伤组织鲜质量，g。
1.3 数据处理与分析
采用Excel 2003和SPSS 22.0软件对数据进行统计处理，采用Duncan"s新复极差法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同浓度蔗糖处理对木薯胚性愈伤组织中3种保护酶活性的影响
蔗糖既是植物组织培养中的最主要碳源，也是重要的渗透调节物质[3]。由表1可知，保存期间蔗糖处理的木薯胚性愈伤组织SOD、POD、CAT活性均高于对照组，表现出随着蔗糖处理浓度的升高，SOD、POD、CAT活性先升高后下降的趋势，活性最高点均出现在蔗糖浓度为30 g/L时，此时与其他处理差异显著（P<0.05）;表明在蔗糖渗透胁迫下，较高活性的保护酶系统能够有效地清除木薯胚性愈伤组织内过多的活性氧，维持活性氧产生与清除之间的动态平衡。蔗糖浓度超过35 g/L时，SOD、CAT活性开始缓慢下降，而POD活性表现急速下降，说明活性氧的增加远大于正常清除能力，过多的氧自由基使细胞内多种功能膜及酶系统遭到不同程度的破坏，生理代谢紊乱，POD活性就可能受到抑制而急速下降[15]。由此可以看出，适当浓度的蔗糖可以提高木薯胚性愈伤组织的抗氧化酶活性。
2.2 不同浓度甘露醇处理对木薯胚性愈伤组织中3种保护酶活性的影响
甘露醇是活性氧清除剂[16]，作为一种重要的多元醇，还可直接清除·OH，抵抗氧化反应[17]。由表2可以看出，随着甘露醇浓度（0～30 g/L）的不断升高，木薯胚性愈伤组织中的SOD、POD、CAT活性不断升高，其中20、30 g/L甘露醇处理与对照差异显著。30 g/L甘露醇处理的3种保护酶活性维持在较高的水平上，SOD、POD、CAT活性值分别比对照升高63.27%、56.42%、59.81%，除浓度在30～40 g/L之间POD活性差异不显著外，其他各处理之间的3种保护酶活性均差异显著，说明胁迫处理下胚性愈伤细胞中3种保护酶活性被诱导升高，直到浓度高达40 g/L时才开始呈现缓慢下降的趋势，这可能是由于高浓度处理超出了细胞的生理耐受和反应极限，破坏了正常细胞生理活动。由此可见，甘露醇浓度为30 g/L时可以有效增强木薯胚性愈伤组织的SOD、POD、CAT活性，且3种保护酶活性升高与愈伤组织抗衰老密切相关，可作为愈伤组织生长过程中增殖和衰老的标志酶。
2.3 不同浓度多效唑处理对木薯胚性愈伤组织中3种保护酶活性的影响
多效唑作为高效低毒的植物生长延缓剂，可以延长培养物在试管中的保存时间[18]。由表3可以看出，木薯胚性愈伤组织在多效唑浓度为4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L处理下，SOD、POD、CAT活性显著高于对照，8.0 mg/L多效唑处理的3种保护酶活性维持在较高的水平上，分别比对照升高63.09%、63.73%、93.20%，SOD、POD、CAT活性的最高值是愈伤组织生长高峰期到来的标志。3种保护酶活性随着多效唑浓度的升高呈先升后降的趋势，6.0 mg/L与8.0 mg/L多效唑处理下，木薯胚性愈伤组织中的SOD、POD活性差异不显著，8.0 mg/L 多效唑处理的CAT活性与其他处理组差异显著，10.0 mg/L浓度处理下，3种保护酶活性急速下降，说明培养基添加多效唑在一定程度上使3种保护酶活性增强，从而减弱膜脂过氧化作用，有效地延长愈伤组织的继代周期。综合分析认为，生长延缓剂多效唑在木薯胚性愈伤保存中的适宜浓度为8.0 mg/L。
3 结论与讨论
SOD、POD、CAT是抗氧化酶系统中控制植物体内活性氧积累的最主要的3种保护酶，其活性变化与衰老密切相关。抗氧化酶活性的提高有利于减缓愈伤组织中活性氧对细胞的氧化损害，减缓其细胞膜质过氧化并抑制褐化[19]。POD是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶，其与SOD共同作用能减轻或消除氧自由基对植物生长发育的不良影响[20]。CAT广泛存在于植物体内，其活性与植物体的成熟衰老关系非常密切[21]。本试验结果表明，在常规固体保存培养基（GD培养基+12.0 mg/L毒莠定+6.5 g/L琼脂）上附加蔗糖30 g/L、甘露醇30 g/L、多效唑8.0 mg/L时，木薯胚性愈伤组织的3种保护酶活性均有一定幅度的增强，可在一定程度上延缓解木薯胚性愈伤细胞的衰老，有效地延长愈伤组织的继代周期，进而达到延长保存时间的目的，是一种对木薯种质资源离体保存的方法。
蔗糖是植物组织培养中不可缺少的碳源和能源，同时还起着调节渗透压的重要作用[22]。本试验结果表明，经蔗糖处理保存的木薯愈伤组织的SOD、POD、CAT活性比常规保存的对照处理高，在30 g/L蔗糖浓度胁迫下，3种保护酶活性一直维持在较高的水平上，主要原因是添加蔗糖后，培养基碳源充足，细胞生命活动旺盛，过快的生理反应使活性氧的产生较多，高浓度（35～40 g/L）蔗糖迫胁下呈下降趋势，不利于木薯胚性愈伤离体保存。
在植物离体保存研究中，常利用甘露醇来延缓细胞衰老，以达到延长继代时间的目的。甘露醇在植物组织培养中是一种调节渗透压的添加剂，通过给植物造成“饥饿”的作用，延缓植物代谢速率，达到延緩衰老的目的，在多种植物的保存试验中均取得了很好的效果[23-25]。不同植物培养物保存所需要渗透压并不相同，本试验研究得出，30 g/L甘露醇能将木薯胚性组织的3种保护酶活性维持在较高水平。
离体保存成功的关键因素之一是使用合适的植物生长抑制剂。多效唑（PP333）是一种生长延缓剂，对植物的营养生长有较强的抑制作用，在荔枝胚性愈伤组织保存试验中取得较好效果[26]。本试验结果表明，在常规保存培养基中添加不同浓度的生长抑制剂多效唑，对木薯胚性愈伤组织保存试验中3种保护酶活性影响差异较大，其中8.0 mg/L多效唑处理显著高于对照，3种保护酶活性一直维持较高水平，说明能延缓细胞衰老，延长继代时间。综合试验结果，8.0 mg/L多效唑处理较适合木薯愈伤组织中离体保存。
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