乔 江,王 叶,吴肖男,孙晓峰,刘 祎,陈智芬
1.湖南中医药大学第一附属医院妇产科，湖南长沙410007；
2.湖南中医药大学第一中医临床学院，湖南长沙 410208；
3.湖南中医药大学组织胚胎学教研室，湖南长沙 410208
近年来，我国女性不孕症发病率呈上升趋势，高达11%，其中输卵管炎性不孕为女性输卵管因素不孕的最主要原因[1-4]。西医治疗该病的主要方式有子宫输卵管造影、宫腹腔镜手术治疗、辅助生殖治疗等[5-6]，辅助生殖治疗的运用较大解决了输卵管性不孕的生育问题，但其治疗技术要求高，费用昂贵，且仍存在反复着床失败、卵巢过度刺激等方面的问题，许多妇女仍难以接受这项技术[7]。丹荔输通汤为第四批全国名老中医药学术经验指导教师杨秉秀教授60余年治疗输卵管炎性不孕之经验方，临床疗效显著，前期研究中发现，丹荔输通汤能明显降低输卵管炎性阻塞患者血清细胞间黏附因子-1(ICAM-1)水平，升高血清血管内皮生长因子(VEGF)水平，但对输卵管局部炎性微环境及调控机制的影响尚不明确[8]。本研究旨在探究丹荔输通汤治疗慢性输卵管炎性阻塞的作用机制，为提高丹荔输通汤的临床疗效及推广运用提供更可靠、更科学的实验依据，并实现对名老中医经验方的传承、优化与创新，为临床中药新药研发提供前期基础。
1.1标本来源 SD健康雌性大鼠84只，湖南中医药大学动物实验中心提供(SPF级)。饲养温度为18～24 ℃，湿度为30%～70%，体重为180～200 g。合格证号：No.1107272011007368。
1.2实验药物 中药：丹荔输通汤为第四批全国名老中医药学术经验指导教师杨秉秀教授经验方，组方由丹参15 g、荔枝核15 g、刘寄奴15 g、王不留行10 g、桃仁10 g、赤芍10 g，生黄芪15 g、太子参15 g等组成，以上饮片由湖南中医药大学第一附属医院中药房鉴定并提供。阿奇霉素混悬液：阿奇霉素干混悬剂(0.1 g×6包)，购自湖南中医药大学第一附属医院西药房，批号为200101，加蒸馏水10 mL制成阿奇霉素混悬液。造模药物：液化苯酚(500 g×1瓶)，购自湖南麦克林试剂有限公司，批号为P815401。羧甲基纤维素钠(500 g×1瓶)，购自湖南麦克林试剂有限公司，批号为C804625。灌肠药物为丹荔输通汤灌胃制剂。
1.3仪器与试剂 轮转石蜡切片机(徕卡RM2235)、生物组织摊片机(金迪YD-A)、电热恒温培养箱(上海一恒DNP-9162)、数码医学图像分析系统(Motic 6.0)、实时荧光定量PCR仪(WaferGen Biosystems)、漩涡混匀仪(Kylin-Bell)、掌式离心机(Kylin-Bell)、热循环仪(Life)、电泳仪(上海天能科技有限公司)，以及R1600型DEPC处理水(Solarbio)、10006818型三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)、#41003型GelRed染料(Biotium)、9168型NA Loading Buffer(TaKaRa)、T9122型Tris-Borate-EDTA Buffer(TBE) 10×Powder,pH8.3(TaKaRa)、DP419型RNAsimple Total RNA Kit(天根)、K1622型RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher)、TB Green®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(ThermoFisher)、兔抗鼠转化生长因子(TGF)-β1和Smad2多克隆抗体(武汉proteintech公司)、Smad3单克隆抗体(武汉proteintech公司)、山羊抗兔IgG二抗(武汉proteintech公司)。
1.4方法
1.4.1实验分组与造模 大鼠适应性饲养7 d后，按体重进行编号，用随机数字表法抽取11只大鼠作为空白组(A组)，其余73只大鼠全部苯酚明胶造模法制作慢性输卵管炎性阻塞模型[9-10]。以10% 水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，将73只造模大鼠仰卧固定，腹部剪毛备皮，碘酒、酒精消毒，铺巾，于耻骨联合向上约0.5 cm处作纵形切口，长1.0～1.5 cm，打开腹腔，暴露Y形子宫，沿子宫找到双侧输卵管，于子宫靠近输卵管处向两侧输卵管分别注入15%苯酚糊剂0.03 mL，然后缝合创口。术后消毒术区，铺无菌垫料，正常饲养。造模第25天，A组与73只造模大鼠中分别随机处死3只大鼠进行病理检测，术中及HE染色见A组3只大鼠输卵管管腔形态规则，管壁富有弹性，质地柔软，色泽鲜亮，未见充血、肿胀、扭曲等病变，与周围组织无粘连。3只造模大鼠输卵管管腔扭曲、畸形，管壁结缔组织增生纤维化，质硬，管壁增粗、阻塞，充血、水肿较为明显，大量炎性细胞浸润，与周围组织广泛粘连。确定模型制备成功，在模型制备过程中，有4只大鼠死亡。经病理检测造模成功后，将66只造模大鼠随机分为6组，每组11只，分别为B组(模型组)、C组(丹荔输通汤高剂量灌胃+灌肠组)、D组(丹荔输通汤中剂量灌胃+灌肠组)、E组(丹荔输通汤低剂量灌胃+灌肠组)、F组(丹荔输通汤中剂量灌胃组)、G组(阿奇霉素混悬液灌胃对照组)。
1.4.2给药途径 自造模第31天开始予B组生理盐水灌胃30 d，予C组[14.0 g/(kg·d)]、D组[7.0 g/(kg·d)]、E组[3.5 g/(kg·d)]丹荔输通汤灌胃、灌肠30 d，予F组丹荔输通汤中剂量[7.0 g/(kg·d)]灌胃30 d，予G组阿奇霉素混悬液[10.0 mg/(kg·d)]灌胃 7 d，每天1 次，其余 23 d灌胃等容积生理盐水，每天1 次，灌胃容积均为3 mL，灌肠容积为2 mL。
1.4.3标本检测 实验给药第31天，处死全部大鼠，选取输卵管组织，一部分行HE染色后行形态学检查，染色制成病理切片，电镜下观察输卵管组织病理变化，剩余部分行逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 、Western blot检测，测定组织中的CTGF、Smad7相对表达水平。
1.4.4RT-qPCR检测输卵管组织中CTGF、Smad7转录表达 提取大鼠输卵管组织总RNA，采用分光光度计测定RNA质量。参考Thermo公司反转录酶说明书进行反转录制备cDNA，实时荧光定量PCR mRNA操作如下。根据实验标本数量选择对应规格并在冰上配制如下反应体系，引物设计与合成为TGF-β1上游引物：GACCGCAACAACGCAATCTAT；
下游引物：CGTGTTGCTCCACAGTTGAC；
smad2上游引物：CGTCGGAAGAGGAAGGAACAA；
下游引物：TGGTAAATCTACCCTGCACCC；
smad3上游引物：GGAGGAGAAGTGGTGCGA GAA；
下游引物：GCCACAAGCGGCAGTAGAT。将配置好的qPCR的反应体系(20 μL)置于PCR仪中，65 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，循环40 次，70 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCt法计算大鼠输卵管组织中TGF-β1和Smad2、Smad3相对表达水平。
1.4.5Western blot法检测输卵管组织标本中CTGF、Smad7转录表达 提取输卵管组织蛋白，BCA法蛋白定量，电泳，湿转法转膜完成，丽春红染色试剂染色，观察转膜效果,泳道标记，浸没膜于3%BSA-TBST中室温轻摇30 min封闭，3%BSA-TBST稀释一抗，室温孵育10 min，放4 ℃过夜，第2天在室温孵育30 min。TBST洗膜5次，每次3 min，二抗孵育，5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，辣根过氧化酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(H+L)，稀释浓度1∶10 000，室温轻摇 40 min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3 min，增强化学发光法显影，反应3～5 min，胶片曝光定影后扫描，以β-actin为内参照，软件Total Lab Quant V11.5读取条带积分光密度值。
2.1肉眼观结果 经实验给药30 d后，处死全部大鼠，选取输卵管组织肉眼观察各组大鼠输卵管组织解剖形态变化，具体观察情况如下，见表1。
表1 实验处理30 d后肉眼观
2.2实验处理30 d病理检测结果 经实验给药30 d后，处死全部大鼠，取各组大鼠输卵管组织，HE染色后光镜下观察其病理学改变情况，具体观察情况为A组：输卵管绒毛完整，结构正常，无炎性细胞浸润，未见成纤维细胞；
B组：输卵管腔阻塞，绒毛不完整，破坏严重，腔内有炎性渗出，大量炎细胞浸润；
C组：输卵管形态正常，绒毛完整，结构正常，无炎性细胞浸润，可见少许成纤维细胞；
D组：输卵管无阻塞，管腔正常大小，结构完整，绒毛数量较多，部分有粘连，轻微炎性细胞浸润，可见纤维结缔组织增生；
E组：输卵管轻微阻塞，管腔缩小，输卵管部分绒毛上皮脱落，可见粘连增粗，可见炎性细胞浸润及较多纤维组织增生；
F组：输卵管尚通畅，管腔稍有缩小，结构基本完整，绒毛数量减少，部分有粘连，轻微炎性细胞浸润，可见纤维结缔组织增生；
G组：输卵管尚通畅，管腔稍有缩小，结构基本完整，绒毛数量减少，部分有粘连，轻微炎性细胞浸润，可见纤维结缔组织增生。见图1。
图1 各组大鼠输卵管形态HE染色结果(×200)
2.3丹荔输通汤对大鼠输卵管组织CTGF表达的影响 实验30 d后经检测，A组大鼠输卵管组织CTGF相对表达水平较低，B组大鼠输卵管组织CTGF相对表达水平高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。实验处理30 d后，与B组相比，C、D、E、F及G组大鼠输卵管组织CTGF相对表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；
与G组相比，C组、D组CTGF相对表达水平更低，差异有统计学意义(P<0.05)。在丹荔输通汤不同用药剂量上：C、D组大鼠输卵管组织CTGF相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但与E、F组比较，C、D组大鼠输卵管组织CTGF相对表达水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。对于丹荔输通汤中剂量的不同用药方式上:与F组相比，D组大鼠输卵管组织CTGF相对表达水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。
图2 丹荔输通汤对慢性输卵管炎性阻塞模型大鼠输卵管组织CTGF表达
表2 丹荔输通汤对慢性输卵管炎性阻塞模型大鼠输卵管组织CTGF的影响
2.4丹荔输通汤对大鼠输卵管组织Smad7表达的影响 实验30 d后经检测，A组与B组大鼠输卵管组织Smad7相对表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，实验处理30 d后，与B组相比，C、D、E、F及G组大鼠输卵管组织Smad7相对表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与G组相比，C、D组Smad7相对表达水平更高，差异有统计学意义(P<0.05)。在丹荔输通汤不同用药剂量上：C、D组Smad7相对表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，但C、D组Smad7相对表达水平高于E、F组，差异有统计学意义(P<0.05)。对于丹荔输通汤中剂量的不同用药方式上:与F组相比，D组大鼠输卵管组织Smad7相对表达水平更高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3、图3。
表3 丹荔输通汤对大鼠输卵管组织Smad7表达的影响
图3 丹荔输通汤对慢性输卵管炎性阻塞模型大鼠输卵管组织Smad7表达
CTGF广泛存在于多种组织器官中，主要发挥介导细胞黏附、促进血管生成、诱导细胞迁移等作用，可促进机体、器官的生长和发育，刺激胚胎发育等[11-13]。在创伤愈合及心、肝、肾、肺等器官纤维化发生中CTGF明显过度表达，并与TGF明显相关，是TGF-β1关键的下游分子[14-16]，Smads是TGF-β受体作用的直接底物，不同的Smad介导不同的TGF-β家族成员的信号转导[17-19]。Smad2在TGF-β生物学功能效应发挥中起着关键作用，可能是与组织纤维化最密切相关的蛋白质之一，Smad7是一个抑制型蛋白，可与Smad2竞争结合TGF-β受体，能阻断Smad2磷酸化，从而抑制TGF-β/Smads通路的转导，抑制输卵管炎性反应，延缓输卵管的纤维化[20-24]。目前研究已发现纤维化器官中Smad7的相对降低可能引起促纤维化的信号传递反应增强，并通过有丝分裂原及CTGF mRNA表达水平增加，导致细胞外基质(ECM)和CTGF的增多，CTGF的过度表达，可诱导纤维蛋白酶抑制剂的合成增加，阻止ECM的降解，使组织的ECM积聚，进而发生器官和组织的纤维化，Smad7的高表达可抑制CTGF的表达[25-30]。丹荔输通汤为第四批全国名老中医药学术经验指导教师杨秉秀教授治疗输卵管炎性不孕的经验方，该方由丹参、荔枝核、刘寄奴、王不留行、桃仁、赤芍，生黄芪、太子参等组成，方中丹参为君药，丹参功用凉血化瘀，方中荔枝核、刘寄奴、王不留行、赤芍、桃仁为臣药行气通络、活血化瘀，桃仁、赤芍均为妇科治瘀血要药，二者配伍，破妇人血闭腹痛，王不留行通经行血，善治妇科月经不调、血症等，刘寄奴功擅破血行经，生黄芪、太子参为佐药，益气扶正，助气行血，全方标本同治，体现攻补兼施、消散结合、气血兼顾的治疗特点，使得气血旺盛、瘀血荡涤、脉络通畅，从而达到使输卵管的充血消退、水肿减轻、纤维化缓解的作用。前期临床研究表明，该方能明显降低输卵管炎性阻塞患者血清ICAM-1水平，升高血清VEGF水平，改善患者炎症状态。本研究结果显示，经丹荔输通汤治疗后的慢性输卵管炎性阻塞模型大鼠输卵管组织局部形态得到不同程度的恢复。通过RT-qPCR、Western blot 检测各组输卵管组织CTGF、Smad7表达发现，丹荔输通汤能够抑制大鼠输卵管组织CTGF、上调Smad7表达，从而抑制输卵管组织炎性反应与纤维化形成，改善恢复输卵管生理功能。不同剂量丹荔输通汤对慢性输卵管炎性阻塞模型大鼠输卵管组织CTGF及Smad7表达影响有差异，C组、D组对大鼠输卵管组织CTGF、Smad7表达的影响优于E组、F组及G组，D组对大鼠输卵管组织CTGF、Smad7表达的影响优于F组，为丹荔输通汤治疗慢性输卵管炎性阻塞的最佳治疗方案提供理论及实验依据。中医药在某些妇科疾病治疗上有着不可替代的优势，如盆腔炎性疾病后遗症、不孕症、子宫内膜异位症、异位妊娠等[31-32]。虽然疗效确切，但目前药物的作用机制不够明确，因此，不断发挥中医药优势，学习新知识、掌握新的科研方法与技术，也是中医药文化传承与发展的重要一步。
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