刘华彬 王 玲 杜展颜 王 松
（安徽科技学院生命与健康科学学院 安徽凤阳 233100）
植物学实验技术是开展植物生长发育相关研究的重要工具。在遗传学研究中，植物有性杂交技术被广泛应用于科学研究和生产实践中。植物的杂种优势是自然界普遍存在的生物学现象，即利用具有不同遗传组成（基因组）的同种或不同种生物个体，通过杂交以获得具有父本和母本优势性状的子代个体。在生物遗传育种、农业生产及遗传分析中具有重要意义。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为经典的模式植物，具备模式生物的重要特征，例如，生长周期较短、结实率高、基因组小、易于培养与转化等，是第1种完成全基因组测序的植物[1]，因此，被广泛应用于科学研究之中。在遗传学实验中，利用拟南芥生长周期短的特征，可在较短的时间内获得所需的实验材料。植物有性杂交技术是经典的生物学实验技术之一，是研究植物的遗传机制和作物遗传育种的重要工具。
植物杂交是基因重新组合的过程，通过有性杂交将亲本双方控制不同性状的基因整合至杂交子一代个体中，从而使子代获得双亲的优良性状，在植物个体的生长、产量、品质、抗性和适应环境能力等方面表现出杂种优势的特点，最终获得符合生产需求的新品种。植物杂交也是植物进行有性生殖的过程，双受精是被子植物所特有的生殖现象[2]。在这一过程中，成熟的花粉通过昆虫、风力或其他外界条件影响，传送至柱头上并与之相互识别进而完成授粉[3]。在一些自然授粉效率较低的植物中或在作物遗传育种中，常需要进行人工授粉，即通过人工操作将植物的花粉传送至柱头上以帮助其授粉[4-7]。在植物遗传分析和作物育种过程中，通过有目的地选择亲本进行杂交实验以实现方向性改变植物的遗传特征[6-7]。花粉作为父本遗传信息的携带者，授粉成功后形成的子一代继承了双亲的遗传性状[8-10]。在植物杂交育种实验中，可通过表型观察或遗传信息鉴定F1代杂合植株。
2.1 教学目的 掌握种子植物的人工授粉技术，了解种子的形成过程；
掌握杂种植株鉴定技术。
2.2 教学重点与难点
1）重点：父本和母本的选择，人工授粉。
2）难点：去雄操作，F1杂合植株鉴定。
2.3 实验设计
2.3.1 实验材料准备
植物材料：生长5～6周的拟南芥植株，处于旺盛的开花期。
实验器具：正置荧光显微镜、光照培养箱、杂交镊子、保鲜膜。
2.3.2 实验内容 以突变体拟南芥（mutant，m）为母本，携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标签的转基因拟南芥（A-GFP）为父本，进行杂交实验。
2.4 教学安排
本实验共分为5个阶段：1）植物的培养（实验教师完成）；
2）父本和母本的选择，以及人工去雄（2学时）；
3）人工杂交（2学时）；
4）实验结果观察（2学时）；
5）F1杂合植株鉴定（2学时）。
实验中2～3位学生为一组，每位组员都要进行一次完整的实验操作过程，积极分享和讨论实验中的技术要点，共同观察实验结果，并对失败的实验进行分析和总结。
3.1 实验材料的准备 培养5～6周的拟南芥，处于旺盛的开花期（图1）。
图1 实验材料和器具的准备
3.2 父本、母本的选择 父本选取开花旺盛的13～14期的拟南芥花[11]，花瓣完全舒展开，呈十字形（图2A）。每朵花中包含6枚雄蕊，4长2短，雄蕊位于雌蕊的周围、花瓣的内部，花药呈黄色，表明此时期的花粉已成熟。若雄蕊已成熟，而雌蕊尚未发育或雌蕊状态不佳，可先将取下的花药置于保鲜袋或无菌的离心管中，4℃低温冰箱内密封保存3～5 d。待母本花期适宜时，选取生长状态较好的花蕾进行去雄，然后即可进行人工授粉。
母本的选择应确保雌蕊尚未进行授粉。选取未开放的9～12期的花[12]，花蕾较多的分枝或主枝，此时，整朵花被白色的花瓣和绿色的萼片紧紧包住，在花的顶端只露出一点白色（图2B）。用75%乙醇对镊子进行消毒，将选定的母本花蕾进行人工去雄，并用保鲜膜包裹，光照培养箱培养1～2 d，等待柱头长大呈现毛茸茸的状态（图2C）。
图2 拟南芥人工授粉
3.3 拟南芥有性杂交 待雌蕊的柱头呈现肉眼可见毛茸茸的状态（图2C），此时进行授粉的成功率显著提高。首先，用75%乙醇对镊子进行消毒；
用消过毒的镊子夹住成熟雄蕊的花丝，将花药在雌蕊的柱头上来回摩擦、涂抹几次（图2D）。人工授粉后，用保鲜膜将雌蕊套袋，防止外界的花粉落到柱头上干扰实验。授粉时间一般在上午9∶00—11∶00之间为佳。
在对杂交的父本、母本进行标记时，母本（雌蕊）一般用F（female）或♀表示，父本（雄蕊）一般用M（male）或♂表示。例如，突变体（mutant）作母本，转基因拟南芥A-GFP作父本，则标签上应记录为m（F）×A-GFP（M）-F1，F1代表杂交产生的第1代种子。
3.4 杂交后实验观察 人工授粉后1～2 d，观察柱头的生长情况。如果柱头长大，花柱伸长，则表明杂交成功；
如果柱头未发育长大，则说明杂交失败（图2E）。此时，要仔细观察柱头的形态，如果柱头仍为毛茸茸的状态，可再进行一次人工授粉；
如果柱头出现萎蔫或干枯，则表明杂交失败，需要重新进行实验。将植株置于光照培养箱正常培养，一般3～7 d，角果即可显著伸长（图2E）。待种子成熟后即可收取F1种子，用于后续的实验。
3.5 F1杂合植株鉴定 F1杂合植株继承了双亲的遗传信息，因此，杂合植株表现出亲本的遗传性状。F1代杂合植株的鉴定，只需鉴定F1植株基因组是否含有父本的遗传信息即可，这主要是由于来自父本的花粉传粉至母本雌蕊的柱头上，并成功完成授粉，则发育形成的种子及其F1代植株均含有来自于父本的遗传信息。因此，可对F1代植株是否包含来自于父本的遗传信息或表现出父本的遗传性状进行鉴定。
绿色荧光蛋白编码基因是一种广泛应用于生物学研究中的标记基因，GFP在波段为395～490 nm的激发光作用下发出独特的绿色荧光[13-14]。在植物学研究和作物杂交等相关实验中，常可利用GFP作为父本遗传信息的标记基因[14-15]。在对F1代杂合植株鉴定时只需对其进行GFP荧光观察，如果F1代植株在荧光显微镜下观察到绿色荧光则表明其为杂合植株；
如果观察不到绿色荧光则表明杂交失败。
本实验在对F1植株进行鉴定时，取杂交成功后的成熟种子，经消毒后在MS固体培养基上萌发并竖直培养7 d，待植物根系长至1.5～2.0 cm左右，将植物幼苗置于荧光显微镜下使用GFP激发光激发，进行观察。实验选用mutant（m）作为母本（无荧光标记基因，图3A和3B），A-GFP作为父本的标记基因（图3C），F1代（m×A-GFP）植株经过荧光显微镜观察到绿色荧光（图3D），表明杂交成功，即F1为杂合植株。
图3 F1代杂合植株鉴定
4.1 教学实验开设的意义 拟南芥作为科学研究中的模式植物，被称为植物界的“果蝇”。了解拟南芥植物的生长习性和繁殖器官的形态结构，掌握科学研究中的基本实验技能，是培养大学生科研兴趣和动手能力最好的实验教学。通过该实验课程的学习，可使学生了解植物培养的基本方法、掌握杂交育种的基本原理和实验技术。
4.2 实验课程安排与教学计划 该实验技术成熟、稳定，结果直观可靠且易获得。大多数高校实验室都具有本实验使用的实验仪器，例如，正置荧光显微镜、植物光照培养箱或培养室等，具备开设本实验的条件。
本实验课程作为遗传育种学实验课或本科生科研专题训练项目，建议4次实验课（8学时）为宜；
由实验教师完成植物的培养，学生主要进行去雄、杂交与鉴定实验。
4.3 实验教学过程中注意事项 本实验成功率的高低在于对母本的选择及人工去雄的操作技巧。母本选择尚未授粉的雌蕊，此时的花蕾处于发育早期，在花蕾的顶端刚好露出一点白色花瓣。在去雄操作中，一定注意动作的轻缓，不要触碰或弄伤雌蕊。在杂交过程中，镊子要保持干净，每进行一次杂交实验，都要清洁镊子尖端残存的花粉粒，以免其他花粉粒落到柱头上干扰实验结果。
4.4 本实验课在高校教学中的应用 该实验是认识植物生长繁育规律、掌握植物基本实验技能的实践课。要求教师将完整的知识体系、实验原理、操作技巧、注意事项详细地展现给学生，让学生既能领会到植物世界的奥妙，又能学到科学知识和实验技能。经过本实验课的学习，学生既能了解植物生长发育和繁育后代的生命过程，又能掌握学科理论知识、实验设计技巧和基本的实验技术。
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