魏家阳，李 丽，王国康，徐英英，曾 哲，罗青平，邵华斌，温国元，商 雨*，潘兹书
(1.武汉大学生命科学学院，湖北武汉 430072；
2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室，畜禽病原微生物学湖北重点实验室，湖北武汉 430064)
新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是一种以禽类作为宿主的RNA病毒，其基因组为单股、负链、不分节段的RNA[1]。NDV按照毒力可以分为强毒株、中等毒力毒株和弱毒株。弱毒力毒株可在家禽体内有限复制，并能刺激系统免疫反应，可开发为活疫苗应用于新城疫的防控。随着反向遗传学技术的发展，体外操作NDV的基因组很容易实现，NDV被开发成载体应用于基因工程疫苗的研究。以NDV为载体开发基因工程疫苗有很多优势：①安全性高，NDV在宿主的细胞质内复制，且病毒的生活周期中不会出现DNA，因此，病毒的基因组与宿主基因组重组的概率极低；
②生产成本低，NDV可在鸡胚内增殖很高的滴度；
③免疫方式多样，可以采用滴鼻、点眼、喷雾和饮水等多种方式免疫；
④免疫保护效果好，NDV可以刺激机体产生多种免疫反应，包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫；
⑤遗传稳定性好，多个研究表明外源基因的插入不影响NDV的稳定性，而且多代次传代后的病毒能很好地表达外源基因。因此，在NDV反向遗传学平台被建立以来，大量的基因工程疫苗被研究和评估[2-3]。另外，由于NDV具有严格的宿主限制性，能够进入大多数哺乳动物细胞(包括人类细胞)以及肿瘤细胞，但不能在细胞内复制，同时哺乳动物(包括人类)不存在针对NDV的预先免疫，因此，NDV可应用于预防哺乳动物传染病或治疗人类的相关疾病[4]。
常用于疫苗载体的NDV包含LaSota、Clone-30和TS09-C等弱毒株[5-7]。以NDV中等毒力毒株BC株和弱毒株LaSota株为载体，构建表达人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,HPIV3)HN蛋白的重组新城疫病毒NDV-BC/HN和NDV-LS/HN；
感染DF-1细胞24 h，其中NDV-BC/HN的HPIV3HN mRNA表达水平明显高于NDV-LS/HN或野生型HPIV3；
动物试验结果显示，NDV-BC /HN免疫效果较好，诱导产生的抗体水平高于NDV-LS/HN组[8]。以上结果表明，中等毒力的NDV为载体构建的重组NDV可以快速和高效表达外源蛋白，刺激机体产生较强的免疫反应。另外，随着外源基因的插入，病毒基因组的增大，病毒的复制效率降低，以弱毒株为载体的重组病毒感染能力进一步下降，从而影响到免疫效果[9]。因此，为了提高NDV载体疫苗的免疫效果，可以尝试更多以中等毒力NDV为基础的载体疫苗的研发。
本研究以NDV Mukteswar中等毒力株为研究对象，构建了该毒株的反向遗传学操作平台并拯救出了Mukteswar株病毒，对该病毒的生物学特性进行了测定。NDV Mukteswar株反向遗传学平台的建立，可为研制高效表达外源病原体免疫蛋白的新城疫载体疫苗奠定基础。
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 病毒基因组提取试剂盒，Axygen公司产品；
2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)、2×RapidTaqMaster Mix、反转录试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品；
DpnI、In-Fusion HD Cloning Kit，宝生物工程(大连)有限公司产品；
胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒，美国Omega公司产品；
无内毒素质粒提取试剂盒、胎牛血清和DMEM培养基，赛默飞世尔生物化学制品有限公司产品；
FITC标记的羊抗鸡IgG抗体，北京博奥森生物技术有限公司产品。
1.1.2 仪器设备 PCR仪，美国Thermo Fisher公司产品；
凝胶成像系统，上海勤翔科学仪器有限公司产品；
隔水式电热恒温培养箱，武汉市方正仪器设备有限公司产品；
鸡胚孵化机，山东德州利民孵化机研制中心产品；
CO2培养箱，美国SHEL-LAB公司产品；
倒置荧光显微镜，日本Olympus公司产品。
1.1.3 细胞、病毒和质粒、鸡胚 大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，宝生物工程(大连)有限公司产品；
BHK-21细胞、重组牛痘病毒(vTF7-3)、NDVMukteswar株尿囊液、pACNR-T7载体，辅助质粒pcDNA-L、pVAX-NP、pVAX-P质粒，由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室构建并保存；
SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 NDV Mukteswar株基因组的提取和cDNA的制备 取200 μL NDV Mukteswar株病毒尿囊液，按照病毒基因组提取试剂盒说明书进行病毒RNA提取，提取的RNA用30 μL无RNA酶水洗脱。再按照反转录试剂盒说明书的步骤，将RNA反转录成cDNA，冻存于-80℃备用。
1.2.2 NDV Mukteswar株全长cDNA克隆的构建 以NCBI上公布的NDV Mukteswar株的序列(GenBank登录号为：JF950509.1)为参考，设计9对引物(A1-F&A1-R～A9-F&A9-R)(表1)，相邻的扩增片段间设计有30 bp～50 bp的重叠序列，第1个片段的上游引物和第9个片段的下游引物带有15bp的载体锚定序列。以Mukteswar株cDNA为模板，扩增9个小片段A1-A9，以A1、A2和A3的PCR回收产物为模板，A1-F和A3-R为引物，通过Overlap PCR的方法获取融合片段B1，融合片段B2和B3以相同的方法获得。另设计了一对引物(V-T7F，V-T7R)用于载体线性化。首先通过In-Fusion无缝克隆的方式，将融合片段克隆至pACNR-T7中，获得质粒pACNR-B1，经酶切鉴定和测序正确后，依次将融合片段B2和B3插入载体质粒中，最终获得全长克隆cDNA质粒pAC-Mukteswar(图1)。
图1 NDVMukteswar株感染性克隆的构建策略
表1 构建过程中所用的引物
1.2.3 Mukteswar株病毒的拯救 将生长状态良好的BHK-21细胞传代至6孔板中，待细胞密度达到80%～90%时，感染0.01 MOI的表达T7 RNA聚合酶重组牛痘病毒。感染2 h后，将pAC-Mukteswar质粒与3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)按照质量比例4∶1∶1∶2共转染BHK-21细胞，转染6 h后，PBS洗涤细胞2次，加入含有0.01 g/mL双抗和0.2 μg/mL TPCK-胰酶的DMEM培养基继续培养96 h～120 h，收获细胞培养物，反复冻融3次，用0.22 μm孔径的滤器过滤，接种9日龄～10日龄SPF鸡胚，每枚200 μL，培养4 d～5 d，收集鸡胚尿囊液。测定其血凝(Hemagglutinin，HA)效价，对HA阳性样品进行RT-PCR检测及测序鉴定。鉴定正确的病毒尿囊液命名为rMukteswar。在SPF鸡胚上传3代后，分装保存于-80℃。
1.2.4 间接免疫荧光检测 将BHK-21细胞传至96孔板，待细胞密度达到约80%时，接种病毒尿囊液。感染72 h后弃去培养基，用PBS洗涤3次，以40 mL/L多聚甲醛固定细胞30 min；
用PBS洗涤3次，5 mL/L Triton X-100 (PBS配置) 处理室温20 min，PBS洗3次；
用30 g/L BSA封闭细胞1 h，封闭后用PBS洗3次；
以NDV阳性血清为一抗，以FITC标记的羊抗鸡IgG抗体为二抗进行间接免疫荧光试验，荧光显微镜下观察结果。
1.2.5 病毒生物学特性的鉴定
1.2.5.1 鸡胚半数感染量(EID50) 将rMukteswar和野生Mukteswar株病毒尿囊液进行10倍梯度稀释，10-6～10-9稀释度分别接种3枚9日龄SPF鸡胚，每枚0.1 mL，培养4 d，收集鸡胚尿囊液。测定其血凝效价。记录结果，根据Reed-Maench方法计算病毒的EID50。
1.2.5.2 50%细胞感染量(TCID50) 将重组rMukteswar和野生Mukteswar株病毒尿囊液进行10倍梯度稀释，每个稀释度接种BHK-21细胞(96孔板)，设置3个重复孔，0.1 mL/每孔。37℃、体积分数为5% CO2培养箱培养120 h后，通过间接免疫荧光试验判定病毒感染情况，记录结果，根据Reed-Maench方法计算病毒的滴度。
1.2.5.3 生长曲线 将重组rMukteswar和野生Mukteswar株以0.01 MOI接种于铺有BHK-21细胞的12孔板中，于感染后12、24、36、48、60、72、84、96 h收取细胞培养上清，测定其TCID50，绘制病毒的生长曲线。
1.2.5.4 最小致死剂量的平均致死时间(MDT) 将病毒液进行10倍梯度稀释，10-7、10-8、10-9、10-10、10-11共5个稀释度各接种5枚9日龄鸡胚，0.1 mL/枚。37℃培养，连续观察7 d，记录各个鸡胚的死亡时间。7 d后，将所有活胚冷却，检测HA效价，HA大于27判定为阳性，否则判定为阴性。按照公式计算最小致死量的平均致死时间。
MDT=(在x小时死亡胚数)×x小时+(在y小时死亡胚数)×y小时/死亡总胚数
1.2.5.5 1日龄雏鸡的脑内致病指数(ICPI) 将重组rMukteswar和野生Mukteswar株病毒尿囊液用灭菌生理盐水稀释，分别以颅内接种的方式接种10只1日龄SPF雏鸡，每只50 μL。另取10只接种50 μL灭菌生理盐水作为对照，每天观察记录鸡群健康情况，并对试验鸡进行评定：正常的记0分，发病的记1分，死亡的记2分，连续观察8 d，最后按公式求出ICPI。
2.1 NDV Mukteswar株全长质粒的构建与鉴定
通过RT-PCR获得Mukteswar株基因组的9个片段(图2)，用重叠PCR获得3个融合片段B1、B2、B3(图3)。用In-Fusion克隆方式，将3个融合片段依次克隆至pACNR-T7载体质粒中，获得全长质粒pAC-Mukteswar，用限制性内切酶Hind Ⅲ进行酶切鉴定(图4)，酶切条带与预期大小11 797 bp、3 857 bp和2 162 bp相符。将酶切鉴定结果正确的质粒送往公司测序，结果序列正确，证明全长质粒pAC-Mukteswar构建成功。
M.DNA标准DL 2 000；
1～9.Mukteswar株基因组片段
M.DNA标准DL 5 000；
1～3.融合片段B1～B3
M.DNA标准DL 15 000；
1～2.pAC-Mukteswar质粒
2.2 rMukteswar株全长质粒的拯救与鉴定
将构建成功的Mukteswar株全长质粒pAC-Mukteswar与实验室构建保存的辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L共转染至BHK-21细胞，培养4 d后，反复冻融3次，接种9日龄SPF鸡胚，培养4 d～5 d，选择HA阳性的尿囊液进行病毒RNA的提取，RT-PCR检测及测序分析均与预期相符，表明rMukteswar拯救成功。将鉴定正确的病毒感染BHK-21细胞后，利用间接免疫荧光检测病毒(图5)，感染病毒的BHK-21细胞可以观察到绿色荧光，对照组未检测到荧光信号。
A.rMukteswar感染的BHK-21细胞；
B.阴性对照
2.3 rMukteswar株病毒的生物学特性
为了比较rMukteswar株病毒与野毒株的生物学特性与毒力差异，对两株病毒的鸡胚增殖滴度、细胞生长曲线和毒力进行检测。结果显示rMukteswar株病毒在鸡胚中增殖的病毒含量为109.63EID50/mL(表2)，感染BHK-21细胞后在72 h达到平台期，滴度为107.63TCID50/mL(图6)，与野毒株的增殖特性相似。毒力指标检测结果显示rMukteswar株的MDT为56 h，略大于野毒株，ICPI为1.42，符合中等毒力的特征。
表2 rMukteswar株病毒的特性与毒力指标
图6 rMukteswar株在BHK-21细胞的生长曲线
NDV作为一种安全高效的病毒载体，可开发成用于动物疫病防控的多联多价基因工程疫苗。目前应用于载体开发的NDV多为弱毒力毒株，如LaSota、TS09-C等。由于外源基因的插入，病毒基因组的增大，在感染细胞内基因组的复制效率降低。以弱毒株为载体表达外源基因，将导致病毒的毒力会进一步降低，最终影响免疫效果。另外，NDV特异性母源抗体(maternal derived antibody，MDA)的存在会降低新城疫载体疫苗的效力，研究表明，新城疫疫苗对含有MDA的商业鸡的免疫效果较差[10]。为了克服病毒毒力下降和MDA干扰导致的免疫效果不佳的问题，学者们探索了不同的解决方案，包括构建嵌合病毒、增加免疫剂量、多次免疫、利用细胞因子刺激恢复B细胞的免疫应答，或者使用复制能力更强的疫苗株[11-12]。NDV中等毒力毒株复制能力较强，可引起禽类全身感染，通常比低毒力毒株具有更强的免疫原性[13]。本研究以NDV中等毒力株Mukteswar株作为研究对象，构建其反向遗传操作平台，将为后续开发更高效的基因工程疫苗奠定基础。
Mukteswar株作为中等毒力活疫苗，在国内广泛应用，可在接种后3 d内迅速产生保护作用，并可维持1年以上的免疫保护[14]，表明Mukteswar株是开发基因工程疫苗的理想载体。本研究首先构建rMukteswar株的基因组cDNA克隆pAC-Mukteswar，并将其与3个辅助质粒共转染到预感染vTF7-3的BHK-21细胞，成功获得子代重组病毒rMukteswar。重组病毒rMukteswar株与亲本Mukteswar株具有相似的粒径大小、形态结构、鸡胚增殖滴度和生长曲线。MDT和ICPI测定结果表明重组病毒rMukteswar株与亲本Mukteswar株对鸡胚和雏鸡的致病性无显著差异，且均属于中等毒力毒株的范畴。
综上所述，本研究利用反向遗传操作技术建立了新城疫中等毒力疫苗株Mukteswar的反向操作系统，后期可将rMukteswar株开发为减毒活疫苗以及表达外源病原体免疫原性蛋白的疫苗载体，以期获得外源蛋白高效率的表达系统，提高NDV载体疫苗的免疫原性和保护效果，为安全高效的NDV载体疫苗的研发和广泛应用提供支撑。
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