刘建华，朱荣荣，曾倩华，唐 炜，丁玉庭
(浙江工业大学 食品科学与工程学院/浙江省海洋渔业资源开发与利用重点实验室/国家远洋水产品加工研发分中心(杭州)， 浙江 杭州 310014)
大黄鱼主要分布于南黄海、朝鲜西南岸、东海和琼州海峡以东的南海北部沿岸，是中国四大商业鱼种之一[1]，是蛋白质和不饱和脂肪酸等优质营养物质的来源。大黄鱼因其产量高、味道鲜美以及独特的风味而深受消费者喜爱[2-3]。目前大黄鱼传统的冰鲜方式主要是以片冰、冷海水和冷冻海水将鱼体温度维持在0 ℃左右。近年来，流态冰在冰温保鲜领域的应用越来越受到关注，水产品在应用流态冰保鲜提高新鲜度的同时，还能减少物理损伤[4]。Santiago等[5]、Athina等[6]和Amanda等[7]应用流态冰保鲜水产品，结果均发现流态冰呈现出比传统片冰更好的抑菌效果，进而延长水产品保质期。此外，研究人员发现，臭氧辅助流态冰保鲜技术能进一步延长水产品的货架期。Carmen等[8]、Chen等[9]和Agustimi等[10]研究发现，采用适当质量浓度的臭氧耦合流态冰处理比单独使用流态冰保鲜能更好地抑制腐败微生物生长，对水产品保鲜保质效果更为显著。
鱼体在死亡后，其内源酶降解、三磷酸腺苷降解、脂肪酸氧化和肌肉变性都会导致腥味物质生成[11]，致使大黄鱼新鲜度降低，货架期缩短。因此，气味可以作为评价鱼类新鲜度的重要指标之一[12]。通过顶空固相微萃取结合气相色谱- 质谱联用(SPME-GC-MS)技术和电子鼻分析可以鉴别不同含量的臭氧、流态冰耦合处理条件下的鱼体挥发性风味物质变化。SPME-GC-MS广泛应用于食品中挥发性成分的测定，可以准确定量分析挥发性风味物质，具有灵敏度高、抗干扰能力强等优点[13]。电子鼻技术通过模拟人体嗅觉系统，以传感器来对气味进行客观判别，能对整体风味物质进行有效区分[14]。因此，二者结合可以全面分析挥发性风味物质[15]，且该方法已经广泛应用于食品中不同挥发性风味物质的鉴别[16]。Chen等[17]采用电子鼻分析出生罗非鱼和热加工罗非鱼肌肉中的氧化物香味差异，并用SPME-GC-MS技术在罗非鱼肌肉中鉴定出43种挥发性有机化合物，如醛、酮、醇等。Ding等[18]也用该技术检测了3种淡水鱼鱼露中的挥发性风味物质，其中，SPME-GC-MS技术检测到71种挥发性风味物质，主要为醛类、醇类、醚类，且电子鼻分析显示不同鱼制备的鱼露风味特征有显著性差异。
目前对臭氧- 流态冰(ozone-ice slurry，O-IS)耦合技术的研究主要集中在大黄鱼肌肉品质、生化特性上[19]，关于臭氧- 流态冰对水产品风味作用的研究较少。因此，本研究通过SPME-GC-MS结合电子鼻技术，检测经不同质量浓度臭氧-流态冰处理后的大黄鱼优级品货架期内挥发性风味物质的变化，以期为臭氧- 流态冰耦合技术应用于大黄鱼保鲜提供理论支撑和技术指导。
1.1 材料与试剂
鲜活大黄鱼，购于浙江杭州朝晖六区农贸市场。
氯化钠(分析纯)、溴甲酚绿(生物技术级)、甲基红(酸碱指示剂级)、氧化镁(分析纯，≥98.5%)、硼酸(优级纯)、2,4,6-三甲基吡啶(98%)、盐酸(分析纯,36%～38%)、95乙醇(优级纯)、碘化钾(优级纯,≥99.5%)、硫代硫酸钠(99%)，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
RF- 2.5T/SW型海水流态冰机(2.50 m3/d)，南通瑞友工贸有限公司；
KT- OZ- 10G型臭氧发生器，上海康特环保有限公司；
IMS- 40型碎冰机，常熟雪科有限公司；
K9840型自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份公司；
e2695型高效液相色谱仪，美国Waters公司；
SuperNose- 14- ISENSO型电子鼻，上海瑞玢智能科技有限公司。GC- MS- 7890A型气质联用仪，美国安捷伦公司。
1.3 实验方法
1.3.1样品制备
鲜活大黄鱼购买后于15 min之内运回实验室，用清水冲洗后切成3 cm×5 cm×2 cm左右的鱼块，平均分成5组。实验中碎冰由碎冰机制备，体系温度为-0.20 ℃；
流态冰由海水流态冰机制备，工作液为NaCl质量分数3.50%的盐水，调节流量使体系含微粒冰60%、含水40%，体系终温为-2.00 ℃；
臭氧- 流态冰制备需要将臭氧发生器制备的臭氧通入海水流态冰工作液中，通过控制通入臭氧的时间与流量，最后制得质量浓度为1、3、5 mg/L臭氧- 流态冰。将分好的5组鲜活大黄鱼鱼块样品以1∶1的体积比例，按照层鱼层冰的方式分别放置于不同质量浓度的臭氧- 流态冰中，且样品与碎冰及冰浆直接接触，并包装于聚苯乙烯泡沫箱中，4 ℃冰箱贮藏备用。
1.3.2挥发性盐基氮测定
挥发性盐基氮(TVB-N)根据GB 5009.228—2016方法进行测定。
1.3.3SPME-GC-MS分析
称取优级品鲜度范围内的大黄鱼背部肌肉3.00 g绞碎，其中传统碎冰(FI)组在第5天取样， 流态冰(IS)组在第17天取样，3个O-IS组在第18天取样。加入6.00 mL氯化钠溶液(0.36 g/mL)于15 mL螺纹口样品瓶中，旋紧盖，放入50 ℃恒温箱中恒温30 min。将老化后的萃取头(65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯)插入样品瓶中，推出纤维头，于60 ℃水浴中吸附30 min后取下，插入气质联用仪进行测定。色谱条件：DB-5MS弹性毛细管柱(60.00 m×0.32 mm×1.00 μm)，不分流模式。起始温度40 ℃，以5 ℃/min 升至100 ℃，以2 ℃/min升至180 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，保留5.00 min。载气为氦气，流量1.20 mL/min，进样口温度250 ℃。质谱条件：电子轰击离子源，电子能量70 eV，离子源温度220 ℃，传输线温度240 ℃，质量扫描范围35～450 Da。挥发性物质定性方法：通过GC-MS分离获得挥发性风味化合物的谱图与NIST2008谱库和Wiley数据库谱图进行比对，仅报道正反匹配度均大于80(最大值为100)的结果。挥发性物质的相对含量计算为某个峰的峰面积与总峰面积比值的百分数。挥发性物质定量方法：内标物为2, 4, 6-三甲基吡啶(trimethylpyridine, TMP)，溶解于甲醇中得到10.00 g/L的标准母液。TMP标准母液进一步用纯水稀释得到10.00 mg/kg TMP工作液。将40.00 μL TMP工作液加入6.00 g鱼肉样品中，立即密封进行鱼肉样品萃取过程。
1.3.4电子鼻分析
对应1.3.3的取样时间，每组样品称取20.00 g进行检测。将样品放置于40 mL顶空进样样品瓶中，旋上瓶盖，静置30 min，采用顶空进样方式进行检测。电子鼻程序设置为载气流速1.00 L/min，清洗流量2.00 L/min，等待时间25 s，本实验使用设备自带WinMuster软件进行分析。各传感器对应性能如表1。
表1 电子鼻传感器对应物质类别Tab.1 Corresponding substance category of electronic nose sensor
1.4 数据处理
采用Origin 9.0软件及Excel 2010软件对数据进行统计分析与绘图，用电子鼻中自带的WinMuster软件对不同贮藏时间的挥发性气味进行分析。每组样品做3次平行实验，结果采用平均值±标准差表示。
2.1 O-IS贮藏对大黄鱼TVB-N的影响
蛋白质在酶和细菌的作用下分解生成氨以及胺类等碱性含氮挥发性化合物，TVB-N值通过测定总氮含量的变化作为评价水产品鲜度的重要指标。GB/T 18108—2019《鲜海水鱼通则》规定TVB-N值≤15 mg/100 g时，鱼肉属于优级品。图1显示了不同质量浓度O-IS贮藏对大黄鱼TVB-N值的影响。可以看出，在大黄鱼的贮藏过程中，对照FI组仅能将大黄鱼优级品货架期维持在5 d，而不同质量浓度O-IS处理的大黄鱼优级品货架期被延长。其中IS处理组的大黄鱼优级品货架期被延长至15 d，其余3个O-IS组大黄鱼的优级品货架期延长至18 d。说明相较于FI，O-IS凭借其较高的预冷速度和低温有效抑制腐败微生物和初期自溶阶段内源酶的分解作用，减少小分子胺类物质的产生，进而更高效地维持大黄鱼的新鲜度，延长其货架期。并且O-IS的臭氧质量浓度越高，杀灭微生物以及使内源酶失活的能力就越强。
图1 不同质量浓度臭氧- 流态冰贮藏对大黄鱼TVB-N的影响Fig.1 Effects of different ozone concentrations in iceslurry on TVB-N in Pseudosciaena crocea
2.2 O-IS贮藏对大黄鱼挥发性成分的影响
2.2.1挥发性风味物质分析
经SPME-GC-MS检测大黄鱼的挥发性风味物质，分析匹配度大于80%的风味成分，其中具有风味特征的挥发性物质结果见表2。大黄鱼中主要挥发性成分为醛类、醇类、酮类、酯类、烃类及其他化合物和含氮及杂环类，挥发性成分种类及相对含量变化见表3。由表3可知，新鲜组样品中共检出挥发性风味物质34种，IF组中检出28种，IS组与1.00 mg/L O-IS组中均检出29种，3.00 mg/L O-IS组和5.00 mg/L O-IS组检出挥发性风味物质24种。其中醛类、醇类和烃类物质检出的种类较多。
表2 不同质量浓度臭氧- 流态冰处理的优品级大黄鱼挥发性成分变化Tab.2 Changes in volatile components of Pseudosciaena crocea of excellent grade treated with different ozone concentration in ice slurry
表3 优品级大黄鱼挥发性成分种类及相对含量变化Tab.3 Changes in types and relative contents of volatile components of Pseudosciaena crocea of excellent grade
鱼腥味物质主要为羰基类化合物等二级脂肪氧化产物，在贮藏过程中由鱼体内大量的不饱和脂肪酸酶促氧化或自动氧化等途径产生。羰基类化合物主要是醛类和酮类。研究表明，饱和的直链醛、低级醛阈值较低且是鱼体风味的重要影响因素。由表2、表3可知，在新鲜的大黄鱼上检出10种挥发性醛类物质，其中己醛、庚醛、壬醛和(E,E)-2,4-庚二烯醛总量占比较大，而己醛、壬醛、癸醛是公认的鱼腥味物质。FI组、IS组、1 mg/L O-IS组、3 mg/L O-IS组和5 mg/L O-IS组检出的醛类物质分别为9、7、7、5、5种。随着臭氧质量浓度的升高，醛类挥发性物质种类在减少，具有腥味特征的醛类物质含量也降低，表明O-IS耦合处理可以很好地抑制鱼体腥味生成。酮类物质主要呈现桉叶味、脂肪味和焦燃味，可增加腥味，其阈值远高于醛类。但是检出的酮类物质3,5-辛二烯-2-酮，可以与醛类等物质相互作用对腥味物质产生增强或改变的效果[22]。
鱼体中的醇类物质是脂肪酸衍生物及羰基化合物的还原产物，不饱和醇和长链醇能够产生土腥味及一些金属性气味，对风味的影响更为显著，其中1-辛醇是土腥味的标志性物质[23]。由表2可知，1-辛醇是醇类物质中含量最高的，且随着臭氧质量浓度的升高有所降低；
但是从表3来看，醇类物质的检出种类及相对含量在各组之间整体变化不大，说明O-IS处理对挥发性醇类物质影响较小。值得一提的是，1-辛烯-3-醇是大黄鱼重要的腥味物质之一，并且与脂肪氧化产物高度相关[24]，在表2中1-辛烯-3-醇的含量随臭氧质量浓度升高而升高，是因为O-IS耦合处理的氧化作用以及大黄鱼贮藏过程中的自身氧化，致使大黄鱼中硫代巴比妥酸值升高。
烃类化合物主要来自脂肪酸烷基自由基的均裂，其阈值较高，所以对鱼体风味物质影响不大，但是鱼体中的烯烃经反应可转变为醛类或者酮类物质增强鱼体风味[12]。大黄鱼中还检出了二丁基羟基甲苯，它一般是由脂类氧化分解代谢产生，反映了脂肪的氧化程度，而该物质含量变化趋势与臭氧质量浓度正相关，此趋势与1-辛烯-3-醇变化规律相吻合。
本研究表明，O-IS耦合处理对优级品货架期内的大黄鱼醛类物质含量升高有抑制作用。这是因为冰浆的两相特性使细小的冰晶颗粒覆盖在鱼体上方，很好地阻隔了大黄鱼与空气接触，降低脂肪氧化程度减少醛类物质生成。贮藏加工过程中，生物酶降解及微生物生长也可产生腥味物质。O-IS耦合处理能进一步抑制生物酶的活性以及微生物生长。醛类物质溶于水的特性致使其在冰浆的更换过程中会被除去。因此，O-IS耦合处理可以起到降低大黄鱼腥味的作用。但是由于臭氧的氧化作用，较高浓度的臭氧会促进脂肪氧化，尤其结合1-辛烯-3-醇和二丁基羟基甲苯含量来看，1 mg/L O-IS组大黄鱼腥味物质被较好地降解。
2.2.2香气活度值分析
风味物质的特征是由挥发性风味物质在风味体系中的浓度及其感觉阈值共同决定，因此可以通过香气活度值(OAV)判断不同O-IS耦合处理下的大黄鱼中主体风味物质[25]。通过OAV确定新鲜大黄鱼中壬醛、1-辛烯-3-醇、辛醛和己醛(OAV>1)这4种物质是关键风味物质(表2)； 2.3.1主成分分析 电子鼻模拟人的嗅觉S系统，内置14个传感器，由于每个传感器对不同气味的敏感程度不同，电子鼻的传感器载荷分析能够通过相应图谱有效反映某个传感器对样品整体信息的贡献率大小。不同O-IS处理后大黄鱼的电子鼻分析结果见图2。红色五角星代表电子鼻的传感器标记，各种颜色圆点代表输入的 Y 数据。距离越近就认为它们之间的相关性比较大。主成分PC1的贡献率为45.18%，传感器S9、S1和S2主要是反映醇类、烃类和醛类贡献，且其主成分占比与含量呈正相关，而这3种物质是鱼体腥味的主要组成部分。因此，由图2可知，1、3、5 mg/L O-IS组中的腥味物质对大黄鱼呈味贡献低于IF组和新鲜组，所以，O-IS耦合处理技术能够有效降低大黄鱼中腥味物质。主成分PC2的贡献率为35.76%，传感器S4和S8对第二主成分贡献率最大，即对硫化物和短链烷烃有选择性，但是这2种挥发性物质对腥味贡献较低，所以1、3 mg/L O-IS组的大黄鱼腥味物质含量少于其他处理组； 001～005为每组样品的5次平行实验结果。图3 不同质量浓度臭氧- 流态冰贮藏的大黄鱼主成分降维结果分析Fig.3 Analysis of reduced dimensional results of principal components of Pseudosciaena crocea stored in ozone-ice slurry with different ozone concentrations PCA将电子鼻的14个传感器提取的样品信息进行数据转换和降维处理，并对处理结果进行线性分类，最后在坐标轴上形成一个二维散点图，从而快速归纳解释样品整体信息[27]。一般情况下，PCA分析两主成分总贡献率达到70%～85%，由于高贡献率与主成分反映的原始多指标信息呈正相关[28]，所以分析方法可使用。PCA分析结果见图3。由图3可知，FI组与其余样品距离较远，表明FI组气味和其他样品气味差异较大。不同处理组的鱼块与新鲜鱼块均存在一定距离，但新鲜组与1 mg/L O-IS组存在重叠区域，说明使用1 mg/L O-IS 贮藏的大黄鱼与新鲜大黄鱼最接近，该条件下保鲜效果最好。IS组与其他O-IS组距离最大，说明IS组大黄鱼新鲜度与其他O-IS组大黄鱼新鲜度差异最明显。5 mg/L O-IS组与3 mg/L O-IS组有较小重叠区域，说明这2个处理组大黄鱼鱼块的新鲜度差异较小。结果表明，1 mg/L O-IS组在降低大黄鱼腥味物质方面效果最显著，且与挥发性风味物质中醛类物质含量变化相吻合。 2.3.2判别函数分析 判别函数分析(LDA)又称分辨法，是在分类确定的条件下，根据某一研究对象的各种特征值判别其类型归属问题的一种多变量统计分析方法。LDA具有分类效果好、易实现等优点，通常可与PCA法同时使用，以达到更好的分析效果[29]。 001～005为每组样品的5次平行实验结果。图4 不同质量浓度臭氧- 流态冰贮藏的大黄鱼判别函数分析Fig.4 LDA of Pseudosciaena crocea stored in ozone-ice slurry with different ozone concentrations LDA分析法通过将高维度的原始数据信息通过数学运算法则映射投影到低维度方向，对原始数据进行压缩处理，再对样品组间点分布状态与组类间分布距离进行分析，可使组间变异与组类变异比率达到最大[30]。LDA分析结果见图4。由图4可知，主成分1、主成分2及主成分3的总贡献率为99.74%，大于75.00%，可以代表样品大部分信息。且不同处理组的鱼块在响应值区域间距离明显，表明在大黄鱼优级品货架期内，利用LDA分析法能够区分不同处理组的新鲜度，且能证明各组鱼块的新鲜度差异显著(P<0.05)。其中FI组的大黄鱼鱼块响应值区间距离新鲜组最远，结合PC1分析可得出FI组中大黄鱼鱼块腥味含量最高，风味品质降低。除此之外，1 mg/L O-IS组的大黄鱼鱼块相应区间也相距新鲜组较远，结合GC-MS中OAV分析，1-丁烯-3-醇作为最重要的风味物质，在1 mg/L O-IS组中含量降低，说明1 mg/L O-IS组处理条件对鱼块中腥味物质降解效果最显著。 2.3.3分类模型分析 001～005为每组样品的5次平行实验结果。图5 PCA-SVM分类模型建立Fig.5 Establishment of PCA-SVM classification model 利用PCA-SVM支持向量机分类模型算法对不同新鲜度的大黄鱼样品进行分类模型建立，最终得到样品分类模型(图5)。根据图6模型准确度分析可知，该模型准确度为0.944 4(越接近1表示准确度越高，1代表分类完全准确)。这说明本分类模型可以明确区分出不同新鲜度的大黄鱼，利用该模型，可对未知大黄鱼的新鲜度进行预测。 图6 PCA-SVM混淆矩阵Fig.6 PCA-SVM confusion matrix 本研究采用SPME-GC-MS结合电子鼻技术比较了不同质量浓度臭氧- 流态冰耦合处理对大黄鱼优级品鲜度货架期内挥发性风味物质的影响。由TVB-N分析可知，相比较传统碎冰，O-IS耦合技术将大黄鱼优级品货架期由5 d延长至18 d，其中臭氧质量浓度对于优级品货架期无明显影响。SPME-GC-MS分析得出，O-IS耦合处理可以降低醛类物质含量，且臭氧质量浓度越大消降作用越明显。但是从1-辛烯-3-醇来看，臭氧质量浓度增加会致使大黄鱼氧化现象加重。因此，结合TVB-N结果来看，臭氧质量浓度为1 mg/L时与流态冰耦合处理对鱼体腥味物质的消降效果最好。此外，由电子鼻PCA分析和LAD分析可知，挥发性风味物质较易被传感器识别，同样得出，挥发性腥味物质在O-IS耦合处理组中不占据主要贡献地位。本研究结果表明：1 mg/L O-IS耦合处理大黄鱼可以延长大黄鱼优级品鲜度货架期，并且能够明显降低大黄鱼腥味物质含量。本研究旨在为臭氧- 流态冰耦合技术在大黄鱼保鲜过程中品质控制的应用提供参考。
庚醛、癸醛、十四碳醛、1-辛醇和(E，E)-2，4-庚二烯醛对整体风味起到修饰作用(0.12.3 电子鼻检测结果分析
与风味物质分析中醛类、醇类和烃类物质是关键风味物质的结果吻合。传感器S5、S6和S11位于第三象限与主成分PC1和PC2呈负相关，其中S6对应的有机胺、苯酮醇醛是主要腥味物质。而PC3与PC4两者总贡献率小于9.06%，且新鲜组与S5、S6和S11距离最近，同样说明O-IS组的腥味物质被降解。O-IS耦合处理技术可以降低大黄鱼中腥味物质含量，且1、3 mg/L O-IS的处理条件更具优势。
