李玉靖，郑壁伟，欧阳永红△
(1.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518000；
2.广州中医药大学附属清远市中医院，广东 清远 511500)
慢性肾脏病又称慢性肾衰竭，是指各种因素所致的病程不少于3个月的肾脏损害和(或)GFR降低。其中，GFR是慢性肾脏病的分期的主要依据；
而肾脏损害包括肾脏结构或功能异常，病理形态学改变是肾脏结构异常的重要表现，对肾脏诊断及治疗具有指导意义。益气排毒方是广东省名中医欧阳永红教授40余年临证经验的总结，临床运用于慢性肾脏病患者，在缓解患者临床症状、改善肾脏功能的理化指标等方面效果显著。欧阳教授师承团队已对该方在动物实验研究中缓解临床表现和改善理化指标方面疗效进行了总结和归纳[1]。本论文将通过对实验动物进行解剖及肾脏组织病理观察，进一步证实益气排毒方对慢性肾脏病大鼠的肾脏损害具有改善作用，可延缓和抑制病程进展，初步探讨益气排毒方对慢性肾脏病的作用机制，研究讨论益气排毒方组方，为临床推广应用提供实验研究和理论依据。
1.1 材料
1.1.1 动物来源广州中医药大学实验动物中心，SPF级wistar大鼠24只，雌雄各半，体重(200±20)g。
1.1.2 药物 (1)造模药物：维生素B4(即腺嘌呤)，上海延安万象药业生产，每片10 mg。(2)益气排毒方：黄芪20 g，淫羊藿10 g，茯苓15 g，白术12 g，黄精10 g，枳实10 g，丹参20 g，大黄10 g(后下)、煅牡蛎20 g，白花蛇舌草10 g，以蒸馏水500 mL浸泡至少半小时后，慢火浓煎至200 mL(由清远市中医院药学部中药制剂室统一提供)。
1.2 方法
1.2.1 造模采用“腺嘌呤毒害大鼠肾脏”建立慢性肾脏病模型，即随机选取实验大鼠21只，做好标示，用蒸馏水将维生素B4配制成2%的溶液，先以200 mg/kg/d给药量灌胃，连续给药2周；
再以100 mg/kg/d的剂量，连续给药1周。随机抽取造模大鼠1只与正常大鼠1只，心脏取血，标本送清远市中医院检验中心检测肾功能指标，将之处死，分别解剖并观察大鼠肾脏病理，保证造模成功。
1.2.2 分组按重量使用随机数字表法，将慢性肾脏病模型大鼠随机分为：干预组10只(191.26±5.71 g)、对照组10只(188.76±6.81 g)，2组大鼠体重无统计学差异(t=0.8899<2.086，P>0.05)。正常组大鼠给予正常喂养，作为最终参照，证明慢性肾脏病大鼠模型成功。
1.2.3 给药 干预组按正常成人体重剂量14倍给药，经换算为23.38 mL/kg，即平均每只大鼠灌入中药煎剂约4 mL，连续喂养28 d，1天1次。对照组大鼠灌入等量(23.38 mL/kg)蒸馏水。
1.2.4 观察指标
1.2.4.1 肾脏大体观察 给药28 d后处死所有大鼠，摘取肾脏，洗净淤血块，剔除周围脂肪和筋膜组织，吸干肾脏表面水分，称取单肾的重量，算出肾重/体重比值。用生理盐水重新清洗大鼠肾脏，肉眼观察脏器外观(包括大小、色泽、质地、包膜、皮质、髓质、实质等)并做好记录，其后分别浸泡在装有福尔马林的标本瓶中待切片。
1.2.4.2 病理观察 石蜡切片制作方法：肾活检组织经固定(10%甲醛)、脱水(无水乙醇)、石蜡包埋、切片(厚度1.5 μm)、HE染色。
1.2.5 观察内容 (1)肾小球：病理损害程度，包括肾小球增生、萎缩、纤维化等。(2)肾小管：病理改变情况，包括肾小球扩张、阻塞，上皮细胞变性、脱落、坏死等。(3)肾间质：病理改变情况，包括炎性细胞浸润、间质纤维化等。
2.1 基本情况 对照组共10只，死亡2只(第14 d、第18 d)，存活8只(80%)；
干预组共10只，死亡1只(第20天)，存活9只(90%)；
正常大鼠共10只，死亡0只，存活10只(100%)。肉眼观察，正常大鼠精神状态、毛发色泽、生存情况等明显好于2组慢性肾脏病大鼠；
2组比较，干预组优于对照组。
2.2 对肾重体重比的影响 见表1，图1。
表1 2组大鼠实验后肾重/体重比×103 比较情况
正常大鼠(HE×200)
对照组(HE×200)
干预组(HE×200)图1 3组大鼠HE染色肾脏病理变化
慢性肾脏病模型大鼠，均出现肾脏肿胀变大，肾重/体重比值高于正常大鼠。根据2组比较结果，说明益气排毒方可有效减轻肾组织增生情况，延缓肾脏损害进度。
2.3 肾脏大体观察情况 与模型组对比，干预组肾脏表面颜色较深，整体肿胀情况、薄膜增厚程度较轻，说明该方具有保护肾功能的作用。见表2。
表2 肾脏大体观察情况
2.4 HE染色肾脏病理观察
2.4.1 HE染色观察 对照组肾脏组织损害严重，肾小管扩张，部分肾小管堵塞，大量肾小管上皮细胞脱落，内有大量结晶体沉积。与对照组相比，干预组病理损害较轻，部分肾小管扩张，少量肾小管上皮细胞脱落，管内少量结晶沉积。
2.4.2 对照组 肾小管明显扩张，大量肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落，管腔内见大量深黄色结晶体，甚者完全堵塞；
肾小球数量明显减少，部分出现萎缩、塌陷，肾小囊腔内见炎性细胞浸润，部分肾小球球囊扩张，囊壁增厚；
肾间质纤维化，可见炎性细胞、深黄色结晶体。
2.4.3 干预组 肾小管轻-中度扩张；
肾小球数量有所减少，少量萎缩或塌陷，球内系膜细胞增生不明显；
肾间质纤维化程度较对照组轻，内少量金黄色结晶。
3.1 慢性肾脏病大鼠造模方法主要有3种：化学法、物理法和生物法。许亚超等[2]对比研究3种造模方法，显示采用化学法造模成功率和存活率最高；
在症状体征、肾功能指标和肾脏病理等方面，其严重程度较其他两种方法严重。化学药物造模法常用药物包括有腺嘌呤和阿霉素等[3]。本研究采用的是腺嘌呤(即维生素B4)，通过给实验大鼠灌入大量腺嘌呤，在氧化酶作用下转化为2，8-二羟基腺嘌呤，由于2，8-二羟基腺嘌呤为极难溶于水的结晶体，其随血液输送至肾脏，沉积于肾皮质、髓质等部位，并阻塞肾小管，引起肾脏纤维组织增生、免疫炎症反应等，最终导致肾功能损伤[4]。其中，肾间质纤维化、炎症反应是腺嘌呤造模的重要病理改变。通过观察这些病理改变的相关逆变化，则可证明治疗的有效性。
在2组实验大鼠的肾脏病理比较中，干预组在肾组织损害程度、纤维化、晶体沉积等各方面均明显轻于对照组，表明益气排毒方具有减小腺嘌呤的肾毒性，减少结晶体沉积和肾小管堵塞，延缓肾小管变性，抑制系膜细胞增生，抗肾脏组织纤维化，减轻炎症反应等作用。本研究从病理学层面，进一步证实益气排毒方具有改善实验大鼠一般状况，提高生存质量；
改善微循环，加快毒素排出，减少其在体内蓄积，降低血肌酐、尿素氮等指标；
调节钙磷代谢，促进红细胞生成，维持血红蛋白水平等功能。
3.2 欧阳教授研读大量中医古文献，吸收现代中医药研究，结合临床实践所得，对“肾为先天之本，脾为后天之本”非常认同，认为肾脾两脏是治疗肾系疾病的关键所在。肾为元阴元阳之所在，具有温熙的功能，与肾之腑膀胱相合，主气化；
脾主运化，与脾之腑胃相合，共奏升清降浊之功；
两脏可谓是人体生命活动的原动力。脾肾亏虚，则机体运化、温煦功能减退，营卫失调，卫气不能固护肌表而易受外邪，营阴气化不力而内生水湿痰饮。水湿痰饮为阴邪，愈伤阳气，阻碍气机，气不行则血不畅，瘀血乃生。病久病甚则开合失司，当泻不泻，污秽难排，毒素内积，成为“溺毒”等疾。欧阳教授对“久病必瘀”理论十分推崇，强调慢性肾脏病病情缠绵，必兼瘀血。他认为，慢性肾脏病病机就为本虚标实，本虚以脾肾亏虚为甚，标实则有水湿、痰饮、毒邪、瘀血等，治宜以“补不足”“损有余”“攻补兼施”为则，确立了“补益脾肾、祛瘀排毒”的治法，强调活血化瘀应贯穿疾病始终，由此创立了益气排毒方。
3.3 益气排毒方作为欧阳教授40余年慢性肾脏病临证经验升华的产物，在临床中取得良好疗效，得到广泛肯定。该方由黄芪、淫羊藿、黄精、茯苓、白术、大黄、枳实、丹参、煅牡蛎、白花蛇舌草组成，标本兼治，攻补兼施，予攻于补。方中以黄芪、淫羊藿、黄精、白术、茯苓等补益脾胃、益气养阴、渗湿利水；
大黄、丹参、枳实、煅牡蛎、白花蛇舌草攻邪排毒、活血逐瘀。
3.3.1 君药：黄芪、淫羊藿。
黄芪，性温味甘，归脾肺两经，具有益气升阳、利水消肿、托疮生肌之效，《本草纲目》谓其：“补诸虚不足，益元气，壮脾胃”。值得注意的是，此方选用黄芪，而非人参。与大补元气之人参相比，黄芪较为温和，慢性肾脏病者久病体虚，难受峻补，且黄芪具有固表利水之功，取“提壶揭盖”之寓。夏平等[5]通过对基于“肾虚湿瘀”理论治疗慢性肾脏病的相关数据进行分析，有关黄芪研究文献高居第一位，说明黄芪对慢性肾脏病具有良好疗效已是临床和科研的共识。现代药理研究中，胡营杰等[6]研究说明黄芪有效成分可抑制实验大鼠肾小球系膜细胞中表达血小板源性生长因子(PDGF-BB)mRNA及蛋白的表达，从而改善或延缓肾小球硬化。陈伟等[7]发现黄芪多糖能够均有抗氧化抗炎作用，可减轻肾小管上皮细胞炎症反应；
韩鹏勋等[8]研究表明黄芪甲苷可能通过抑制信号通路活化起到肾脏保护作用。傅天啸等[9]认为黄芪注射液可减轻糖尿病肾病大鼠蛋白尿，降低血清脂联素、抑制肾组织脂联素蛋白及mRNA表达，降低炎症因子水平，延缓肾脏病理损害。
淫羊藿，又名仙灵脾等，性温味辛甘，归肝肾两经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，是临床中常用的壮阳药。首载于《神农本草经》，属中品无毒，“主阴萎绝伤”兼有“利小便”之功。李时珍纠正其性“温而不寒”，强调其能“益精气”，“真阳不足者宜之”。淫羊藿对慢性肾脏病疗效明显，并引起广泛关注。在统计数据分析中，有关淫羊藿研究文献数量居补阳药中第二位[5]。赵锦等[10]认为淫羊藿苷对实验大鼠可降低氧化应激水平、减轻炎症反应，抑制细胞外基质增生和肾组织细胞凋亡。张红等[11]研究认为，淫羊藿苷对IgA肾病大鼠通过调控NF-κBp65、MCP-1因子的表达以及机体免疫调节等途径，实现肾脏保护作用。人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)体外实验显示，淫羊藿苷可促进HK-2细胞增殖，抑制纤维连接蛋白mRNA及蛋白表达，发挥抗TGF-β1诱导的HK-2细胞向成纤维细胞转化的作用[12]。
3.3.2 臣药：黄精、白术、茯苓。
黄精，又称老虎姜，性味甘平，有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。清远连州盛产此药，当地人常以泡制“黄精酒”，补而不燥，润而不腻。欧阳教授在清远从医数十年，对此药颇有心得，认为其擅滋肾阴，将之与淫羊藿相配，寓意“阴中求阳”。现代研究表明，黄精化学成分复杂，主要有多糖、皂苷、黄酮等，具有降糖、护肾、抗老年痴呆等药理作用。陈宇等[13]整理分析，黄精通过抗肾间质纤维化、抗炎、抗氧化应激等多重作用机制，发挥保护肾脏的作用。彭静等[14]研究表明黄精皂苷可以抑制肾小管间质纤维化进程，保护肾脏。白术、茯苓是健脾渗湿利水的经典药对。白术甘温苦燥，擅于守中；
茯苓甘淡渗湿，长于下行。两药为伍，不温不燥，一补一渗，守中有通，相须为用，相得益彰。白术、茯苓与黄芪相配伍，还寓有健脾补气经典方四君子之意。在两药相关研究文献数量统计中，白术在补气药中居第二位，茯苓在利水药中居首位[5]。郑晓珂等[15]研究认为，白术注射液通过增强抗氧化酶抗氧化，白术多糖能改善肾脏滤过屏障泌尿功能和肾小管重吸收功能。白术还能改善阳虚型慢性肾脏病大鼠的环核苷酸水平，降低肌酐、尿素氮等，减轻蛋白尿[16]。李佳丹等[17]研究认为，茯苓多糖可抑制实验小鼠p38MAPK磷酸化，激活PPAR-γ通道，从而改善肾脏损伤。另外，茯苓具有减轻肾小管上皮细胞间充质转分化和细胞外基质在间质区域过度沉积的作用[18]。
3.3.3 佐使药：大黄、枳实、丹参、白花蛇舌草、煅牡蛎均为方中佐使，则重攻邪排毒，活血祛瘀，渗湿利水等功效。大黄、枳实，取义于经方小承气汤，攻下排毒降浊，促进邪毒从后阴排出。孙蒋研等[19]研究发现大黄素对AKI大鼠肠道菌群失衡有一定的调节作用，这可能是其治疗肾损伤的作用机制之一。白亚君等[20]研究表明大黄酚能调节肾脏免疫反应，减轻肾损伤。焦士蓉等[21]研究发现枳实提取物能有效清除多种自由基，起抗氧化作用。丹参集活血补血凉血于一身，古有“一味丹参，功同四物”之说。曹春芽等[22]认为丹参提取物可降低血清尿素氮、肌酐水平，改善肾组织病理状态。陈莎莎等[23]认为丹参酮ⅡA可通过降低氧化应激水平、抗炎、减少细胞凋亡、减轻细胞外基质沉积、改善肾间质微循环、保护血管内皮细胞、阻断细胞信号通路、抑制促纤维化因子的释放等多重作用保护肾脏。白花蛇舌草，是常用岭南草药，具有清热解毒、渗湿利水之效。邹寒冰等[24]研究发现白花蛇舌草可抑制人肾癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等。煅牡蛎具有吸附毒素、收敛固涩精微和纠正钙磷代谢紊乱的作用[25]。
全方配伍严谨，标本兼顾，病证并治，疗效确切。此次动物实验研究中，团队按大鼠体重定量给药，且限于动物辨证的局限性，维持原方，未予加减；
但实际临证中，应三因制宜，辨证论治，随症加减，以达最佳治疗效果。