黄小佳，林广津，张业怀，凌 丁
广西农业职业技术大学，南宁 530007
布氏杆菌病和结核病（以下简称“两病”）都是人畜共患病，养殖从业者、基层兽医工作人员和教学实训场所的师生均属于人畜共患病感染高危人群。“两病”的病原菌可通过人畜呼吸道、消化道、生殖道或皮肤、黏膜进行传播，人类接触带菌动物或食用带菌的乳制品或未煮的肉类均可被感染。为了做到源头治理，确保师生和动物的安全，2020年笔者所在课题组针对农类院校养殖实训场及其未来多功能作用的实际情况，利用动科系微生物实验室，对养殖实训场动物进行布氏杆菌和结核病调查，并对调查结果进行分析，为指导农类院校养殖实训场防控布氏杆菌病和结核病等人畜共患病的安全防护机制提供科学依据，同时为其他院校开展人畜共患病防控及净化工作提供借鉴。
1.1 养殖实训场内部设施设备及周边环境情况
养殖实训场于2014年建成，2015年投入使用，主要由现代养猪场、临床诊疗大棚、综合养殖舍、化尸池等构成。综合养殖舍被栅栏划分为牛舍、羊舍、犬舍，各栏舍之间是在同一环境下有公共的通道相通，同时各种动物栏舍缺少防鼠防虫设施，这种设计的缺陷给生物安全防控带来了隐患。养殖实训场周边是农学、园艺及中草药实训基地，附近3 km 范围内无其他动物饲养。
1.2 实训动物饲养和使用情况
养殖实训场目前牛11 头、羊19 只、马5 匹、犬45 只、兔33 只、禽97 羽。由于受非洲猪瘟的影响，猪存栏为零。动物的来源方式主要为购进，所有动物的饲养模式为圈养。动物的种类和数量随实训课的开展时间、项目而变动，实训课多、班级多，试验动物总体数量多。
1.3 “两病”历年发病情况调查
为全面了解养殖实训场“两病”发生现状，通过查资料及回访曾经在位工作的教师方式在校院内开展“两病”流行病学调查。历年调查发现，养殖实训场没有“两病”发病记录，即使近几年，随着试验动物养殖数量和实验场所人员流动性增加，“两病”也未有发生及疫情报道。根据南宁市疾控中心统计数据，2019年该学院发生了3 例人的结核病病例。但据文献报道，2011—2014年南宁市常住人口结核病累计28 893 例，年均发病率为0.0537%，总体上病例呈逐年上升趋势[1]。可见，“两病”防控形势依然严峻。
2.1 结核病检测
①试验材料。（提纯）牛型结核菌素（20 mL、2万/mL）、禽型结核菌素（冻干）均购自中国兽医药品监察所。油标卡尺；
一次性1 mL 注射器、推剪、一次性帽子、一次性口罩、手套、记号笔等。
②检测动物。养殖实训场所有存栏易感动物。
③试验方法。试验方法及判定标准参照GB/T18646-2002（动物结核病的操作规程）国家标准要求进行。采用结核菌素皮内变态反应（PPD）试验进行检测，同时根据动物种类不同选择不同的结核菌素、注射部位、注射剂量及判定标准，详见表1。
④操作方法。所有待检动物都要进行术前处理：将待检动物编号后在注射部位剪毛，并用油标卡尺测量术部中央皮皱厚度，做好记录。将结核菌素稀释成所需要的浓度备用。注射方法：先以75%乙醇消毒注射部位，然后注射一定量结核菌素，如是皮内注射，注射后局部会出现小包，如注射后不出现包时，应另选大于15 cm 以外的部位或对侧重做。观察结果及处置：注射72 h 后，观察注射部位是否有热痛、肿胀等炎性反应，并测量注射部位的皮皱厚度，做好记录。对疑似反应牛应立即在另一侧注射同批号同剂量结核菌素，再经72 h 观察并记录结果。结果判定：不同的动物判定标准有所不同，详见表1。
表1 养殖实训场实训动物结核杆菌病检测注射部位、剂量及判定标准
⑤检出可疑动物的处理。凡判定为可疑结核病的动物，过42 d 后再进行1 次复检，检测结果是阴性，则判为阴性；
检测结果是阳性，定为阳性；
若检测结果仍呈可疑反应者，则再间隔42 d 复检1 次，结果仍为可疑反应者，则按阳性动物处理[5]。复检结果见表2。
表2 养殖实训场实训动物结核杆菌病初检及可疑病例复检结果 例
2.2 布氏杆菌病的检测
①仪器与耗材。电热恒温培养箱、海尔冰箱、高速离心机LD-2.4、1.5 mL 塑料离心管、50～100 μL移液器、一次性5 mL 注射器、载玻片、吸嘴、试管架、试管等。
②诊断试剂。布氏杆菌虎红平板凝集试抗原、试管凝集抗原、阳性血清、阴性血清均购自中国兽医药品监察所。
③待检动物。全场存栏易感动物。
④血液的采集及血清的制备。血液采集使用一次性注射器，采血量5 mL，不同实训动物的采血部位、方法不同[6]，具体见表3。
表3 实训动物采血部位、方法
采血完毕，将注射器针头向下使整个注射器与地面垂直，并轻轻向上抽动一下活塞，使血液与出口留有1.0 mL 左右的空隙，套上针头套，室温自然凝固后，放入37 ℃的恒温培养箱1 h 取出，放在室温3～5 h 或冰箱24 h 存放后，就可看见淡黄色的血清析出。将注射器的针头、针套取下后，将析出的血清慢慢注入一次性的塑料离心管中，并编号放入-26 ℃冰箱冷藏室，保存备用。
⑤血清检测方法。将所有待测动物的血清先用布氏杆菌病虎红平板凝集试验进行初步检测，结果判为疑似反应的再用布氏杆菌病试管凝集试验进行复检。
⑥虎红平板凝集试验方法及结果判定标准。参照国家标准GB/T18646-2002 动物布氏杆菌检测的操作技术进行。先在灭菌洁净的玻璃板上，用记号笔划出三格，分别放入20 μL 虎红平板凝集抗原，然后分别吸取等量的被检血清、阳、阴性血清分别放入并混匀，在5 min 内出现肉眼可见凝集颗粒现象判为阳性；
无凝集现象，且液体呈均匀粉红色者判为阴性。
⑦试管凝集试验方法及结果判定标准。首先将血清稀释成1∶12.5、l∶25、1∶50、1∶100 4 个稀释度。加入等量稀释好的抗原并混匀，此时血清稀释度依次为l∶25、1∶50、1∶100、1∶200。同时，进行阴性对照、阳性对照及抗原对照试验，并配制比浊管。然后将所有的试管、对照管及比浊管充分振荡后置37 ℃恒温培养箱24 h，取出观察并记录结果。判定标准：参照比浊管及各试管上层液体透明度、管底沉淀物的量进行判定。①++++：管底有明显凝集物下沉，上层液体完全清亮；
②+++：管底有凝集物下沉，上层液体75%清亮；
③++：管底有凝集物，液体50%清亮；
④+：管底有少量凝集物沉淀，液体25%清亮；
⑤－：管底无凝集物，管内液体均匀混浊[7]。
2.3 结 果
应用结核菌素对养殖实训场牛、羊、马、犬、免、禽等6 种动物共210 例进行检测，阳性率为0.95%，说明该养殖实训场实训动物中存在结核病的感染（表2）。
应用虎红平板和试管凝集试验对113 份来自养殖实训场牛、羊、马、猪、犬、免的血清样品进行检测，检出阳性血清0 份，血清阳性率为0，说明目前在养殖实训场实训的动物没有感染布氏杆菌病，检测结果详见表4。
表4 养殖实训场动物布氏杆杆菌病检测结果 例
3.1 结核病
应用结核菌素对养殖实训场牛、羊、马、犬、免、禽等6 种动物210 例进行检测，其中牛11 头、羊19只、马5 匹、犬45 只、免33 只、禽97 羽。检出阳性牛1 头、阳性犬1 只，其余羊、马、免、禽未检出阳性，说明该养殖实训场存在结核病感染，检疫、隔离、消毒等综合防控措施应进一步加强，以达到净化目的。
3.2 布氏杆菌病
本次采集各类动物血清113 份。其中，牛11份、羊19 份、马5 份、犬45 份、免33 份。所有的血清中未检出阳性，血清阳性率为0，说明该养殖实训场布氏杆菌病防控工作取得了一定的效果。
3.3 疾病来源
从调查中了解到，阳性牛和犬都是历年中标商从农贸市场购进，送货时没有带有动物检疫合格的证明，送货之后也没有进行“两病”检测。对于检出的阳性牛、犬立即报告学院并采取了隔离、深埋、消毒等无害化处理，并认真做好登记备案及全场全面消毒等善后工作。
4.1 存在的问题
养殖实训场所是教学实训的重要基地，师生应高度重视结核病、布氏杆菌检测净化和防控，但在调查中发现，该养殖实训场还存在以下问题。
1）管理制度缺失。严格的管理制度是养殖实训场正常运行及动物健康的重要保证。目前，该养殖实训场各项安全管理制度未形成文件，包括试验动物购进原则、试验动物使用规范、卫生防疫制度、试验废弃物无害化处理制度、生物安全教育培训及动物检疫制度等管理制度未出台。即使购进的是健康动物，但在养殖过程中有可能感染疫病。由于制度的不完善，该场管理工作形同虚设，导致常规的“两病”检测也被忽略。
2）实训废弃物处理不彻底。养殖实训场教学试验和科研过程中产生多种医疗废弃物，如一次性PE手套、针头、一次性塑料注射器及动物的组织、血样品、器官、尸体等。目前，只有一次性塑料注射器进行收集，由专门的机构来定期收集、处置，其余的多种废弃物由学生课后直接作为生活垃圾扔入垃圾桶；
化尸池设计存在容量小、使用不到1年动物尸体很快填满，无处安放的动物组织样品、器官、死亡动物尸体则随意填埋，易造成病原微生物扩散。
3）生物安全教育不到位。调查发现，多数教师、学生的生物安全的意识处于空白状态，对人畜共患病的防范意识更是薄弱，表现在教师在进行动物解剖或临床诊断时不戴手套和口罩，徒手进行操作。学生也没按要求进行实训，未养成操作前戴手套的习惯，甚至存在一边上课一边吃食物的现象，离开实训场所时没养成洗手的习惯。
4）试验动物来源背景复杂。目前，教学实训所需要的试验动物几乎是从市场购进，而且由于试验经费和动物栏舍限制，存栏动物种类和数量是随实训需要而变动，多数情况下课程教学需要时才从农村或农贸市场上购买，而且是即买即用没进行任何检疫。动物的防疫状况、健康状况更无法了解。另外，部分试验动物购进时，只要求价格便宜，购进私自生产试验动物，或未要求动物中标公司提供有关检疫合格证明，这些均会导致一些携带病原微生物或已被感染的处于亚健康状态的动物流入养殖场所，给师生造成安全隐患。
4.2 对 策
“两病”的防控是一项长期而艰巨的工作，况且养殖实训场承担着重要教学任务，其“两病”的防控除了采取养殖业常规的监测、检疫、隔离、消毒和科学管理等综合性防治措施，坚持自繁自育，全进全出的管理体制外，还要做好以下工作。
1）完善并落实管理制度。完善养殖实训场严格的生物安全管理制度；
重视并落实师生的生物安全教育培训，让师生意识到安全防护对于减少疫病传播有着重要作用；
从养殖实训场的实际情况出发，把各项规定、要求及制度落到实处，设置生物安全管理岗位责任人，并层层落实安全管理责任；
建设与改造养殖实训场动物栏舍，设置有防外来生物入侵的设施，不同的动物栏舍分区设计分别饲养，以避免交叉污染；
规范化处理废弃物，以减少污染物的扩散，实现从源头上减量控制。
2）加强检测与净化工作。每年春秋两季针对健康动物，利用学生实训的机会开展全面的检测，通过检测工作的开展，早期发现异常动物，并采取针对性措施将传染源清除，使“两病”达到净化的效果。在试验动物引进过程中，要求中标公司选择有产地检疫合格的动物引进，动物运回后应进行30 d以上隔离观察饲养，并进行2 次免疫生物检查，阴性者才能合群。
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