车丽娜 赵良忠 周晓洁
(1. 邵阳学院食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000；
2. 豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室，湖南 邵阳 422000)
脉冲卤制是指利用真空和微压条件，在低温和中温交替过程中完成新型卤制方法。研究[1-2]表明，脉冲卤制在生产过程中具有减少卤汁用量，降低卤制温度，缩短卤制时间，提高生产效率，降低生产能耗，保留食品风味，提高产品安全性等特点。采用脉冲卤制工艺生产的湘派卤牛肉风味浓郁、芳香四溢，营养丰富，大大降低了微生物的初始数量级，极大地提高了卤牛肉的安全性[3]。湘派卤牛肉作为湖湘人餐桌上不可或缺的即食性食品之一，其使用的湘派卤汁是由八角、桂皮等十多种中药材熬制而成，卤制过程中不添加防腐剂、护色剂。其“药卤”“浸渍”“香辣”的特点深受消费者喜爱，具有广大的消费市场，但其常在无包装的情况下销售，极易被微生物污染变质[4]，进而影响食品的安全性，因此对其细菌多样性进行研究十分必要。现阶段对卤牛肉的研究多集中于加工工艺、品质特性及风味物质变化规律[5-8]等方面。
微生物作为卤牛肉研究中常测指标之一，主要采用传统的微生物学分析方法，研究方法较为繁琐，无法较全面地探索卤牛肉中细菌的菌群分布和变化情况。为系统研究卤牛肉中细菌群落结构组成及其多样性变化，研究拟采用高通量测序技术对不同贮藏时间湘派卤牛肉的细菌多样性和菌群结构进行分析，揭示湘派卤牛肉贮藏过程中细菌菌群结构的动态变化，以期为湘派卤牛肉的抑菌保鲜、保持风味和延长货架期提供依据。
1.1 材料与仪器
1.1.1 试验材料
牛肉、猪筒子骨：当天新鲜样品，市售；
卤料：八角、桂皮、小茴香、香叶、甘草、花椒等，市售；
十六烷基三甲基溴化铵抽提液(CTAB)：北京诺博莱德科技有限公司；
高保真PCR预混液与GC缓冲液(Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer)、高保真DNA聚合酶(Phusion®High-Fidelity DNA polymerase)、DNA文库制备试剂盒(NEB Next®Ultra DNA Library Prep Kit)：New England Biolabs；
DNA纯化回收试剂盒：天根生化科技有限公司；
琼脂糖：范德北京生物科技有限责任公司。
1.1.2 试验仪器
脉冲卤煮机(真空脉冲卤制设备)：FYLZ-1型，北京康得利机械设备制造有限公司；
双人单面垂直净化工作台：SW-CJ-2FD型，江苏通净净化设备有限公司；
酶标仪：Multiskan FC型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
高速冷冻离心机：5084R型，德国Eppendorf公司；
PCR仪：PTC100TM型，美国MJ Research公司；
拍击式均质机：BagMixer400CC型，法国Interscience公司；
凝胶成像系统：GelDo-cEQ型，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；
立式高压灭菌锅：GI54DWS型，美国致微有限责任公司；
测序系统：NovaSeq 6000型，美国Illumina公司。
1.2 试验方法
1.2.1 湘味特色卤制牛肉样品的制备 湘派卤汁熬制参照伍涛等[9]的方法，将卤料加入筒子骨高汤中熬制3 h，过滤后加入菜籽油、自制焦糖、食盐等配料。新鲜牛肉洗净切块，置于90 ℃左右的水中预煮3 min，冷却后参照李海涛等[3]的方法进行卤制，卤制参数为卤制温度80 ℃，卤制时间80 min，真空度0.03 MPa，脉冲次数为3。牛肉经当日熬制好的卤汁卤制、晾凉后，用无菌袋密封包装，放至4 ℃冰箱内冷藏贮存。分别于冷藏0，4，8，12，16 d取样，样品于包装内拍击粉碎均匀后，每个时间点取3组平行样。其中贮藏0 d的样品为对照组，分别记为LNR0d1，LNR0d2，LNR0d3，其余组为试验组，分别冷藏4，8，12，16 d，标记为LNR4d1，LNR4d2，LNR4d3，LNR8d1，LNR8d2，LNR8d3，LNR12d1，LNR12d2，LNR12d3，LNR16d1，LNR16d2，LNR16d3。将拍击粉碎均匀的样品于无菌操作台中称取10 g，于20 mL无菌取样杯中密封保存，置于-40 ℃冰箱冷冻，留样待测。
1.2.2 基因组DNA的提取及PCR扩增 采用CTAB法[10]提取样品基因组DNA，并使用质量分数为1%的琼脂糖凝胶对其纯度和浓度进行电泳检测，电泳电压为100 V，电泳时间为40 min，再将适量样品DNA采用10倍稀释法，用无菌水稀释至1 ng/μL，放入EP管中备用。以稀释后的基因组DNA为模板，选择16S rDNA序列引物[11]515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)、806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)进行PCR。
PCR反应体系：15 μL 2×Phusion Master Mix、1 μL 1 μmol/μL PrimerF、1 μL 1 μmol/μL PrimerR、10 μL 1 ng/μL gDNA，ddH2O补足30 μL。
反应程序：98 ℃预变性1 min，循环一次；
98 ℃变性10 s；
50 ℃退火30 s，循环30次；
72 ℃延伸30 s；
72 ℃延伸5 min，循环一次；
维持在4 ℃。
1.2.3 PCR产物的混样和纯化 取5 μL PCR产物使用质量分数为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳电压为80 V，电泳时间为40 min，结合胶图上的marker，判断分子量是否符合目的条带，合格后，对目的条带进行回收。
1.2.4 文库构建和数据处理 使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq6000系统进行上机测序。测序完成后，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接得到原始Tags数据经Qiime软件(Version 1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)对Tags进行截取、过滤、去除嵌合体序列后，利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)对获得的有效序列进行聚类、利用blast方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)与Unit(v8.2)数据库(https://unite.ut.ee/)进行物种注释分析后，再使用MUSCLE(Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)软件进行序列比对，最后使用Qiime软件(Version 1.9.1)、R软件(Version 2.15.3，http://r-project.org)进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析。
2.1 样品基因序列质量评估及Alpha多样性分析
2.1.1 Alpha多样性分析 经高通量测序，15个样品共获得有效基因序列1 116 813条，平均每个样品产生74 454条，有效序列平均长度在415～429，有效序列比例>87%，采用Chao1、Ace、Shannon、Simpson指数以及群落覆盖度指数等对得到的有效优化序列进行分析[12]，结果如表1所示。全部样品的OTU覆盖率为97%～99%，说明测序结果能够准确反映全部样品中的细菌组成。OTU数量与样品中的细菌丰度呈正相关[13]，样品LNR4d、LNR12d和LNR16d的OTU数量偏少，只有200左右，其他样品中的OTU数量基本均在300以上，说明这3个样品中细菌种类较少，其中LNR4d的OTU数量最少，可能是由于样品由室温转至4 ℃冰箱冷藏，在其冷藏过程中，温度骤降，抑制了细菌的生长繁殖，与孙丹丹等[14]的研究结果类似：4 ℃的温度对微生物的生长繁殖有一定的抑制作用，也对延长食品的货架期有一定的作用。而LNR12d和LNR16d的OTU数量骤降，可能是因为在贮藏前期，好氧微生物大量生长繁殖，消耗了包装中的氧气，导致贮藏后期，环境中氧含量降低，抑制了好氧微生物的生长繁殖，且内源酶和外源酶降解了样品中的蛋白质等大分子物质，为优势菌种的生长提供营养物质，使其大量繁殖并产生代谢物和毒素等引起了部分物种死亡[15-16]。Shannon指数大，Simpson指数小，表明样本菌群多样性指数高。LNR0d较LNR16d而言，菌群多样性高；
LNR8d较LNR12d而言，菌群多样性高；
LNR4d菌群多样性最低。Chao1指数、ACE指数越大，表明样品中菌群丰度越高。5组样品中，LNR8d中细菌菌群丰度最高，LNR4d中最低，与OTU数量的变化一致。
表1 样品微生物多样性指数
2.1.2 细菌群落OTU水平的Venn图分析 如图1所示，LNR0d，LNR4d，LNR8d，LNR12d，LNR16d样品中的总OTU数分别为835，294，1 046，442，389，独有的OTU数分别为547，136，793，236，220，5组样品共有的OTU数量为70，而贮藏第0～4，4～8，8～12，12～16天的样品中共有的OTU数分别为132，127，148，116。根据总OTU数量可知，LNR8d中的细菌多样性最高，LNR4d中的细菌多样性最低，与Alpha多样性分析结果一致。样本中独有的OTU呈先降低后升高再降低的趋势，与总OTU变化趋势相似，且前后时间段之间共有的OTU变化幅度较小，说明湘派卤牛肉在冷藏过程中其菌群结构变化较大，但主要菌群变化较小[16]。
图1 样品中细菌群落OTU的维恩图Figure 1 Venn diagram of OTU of the bacterial community in the sample
2.2.3 Shannon曲线分析 Shannon曲线趋于平坦，说明测序深度足够[17]。由图2可知，在对15份湘派卤牛肉中的细菌进行高通量测序时，当测序深度达到50 000时，曲线均趋于平稳。随着测序增加，细菌的多样性几乎不变，表明测序深度达到50 000时已经可以反映样品中细菌的丰度信息。
图2 Shannon曲线Figure 2 Shannon index curve
2.2 湘派卤牛肉贮藏过程中细菌群落组成分析
2.2.1 门水平下的细菌群落组成分析 图3(a)为15个样品除去未分类的菌群，剩余细菌菌群在门分类水平下相对丰度排名前10的菌落结构分布图。总体来看：这15个样品中的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria)，在贮藏期间，厚壁菌门的相对丰度为46.27%～91.88%，变形菌门的相对丰度为3.21%～49.85%，蓝细菌门的相对丰度为0.31%～34.46%，3种菌群的相对丰度呈动态变化趋势。图3(b)为15个样品除去未分类的菌群，剩余菌群组间门水平上的物种相对丰度排名前10的柱形图。由图3(b) 可知，厚壁菌门基本上是湘派卤牛肉低温贮藏过程中的绝对优势菌门，在LNR0d、LNR4d、LNR8d、LNR12d样品中，变形菌门为第二优势菌，而在LNR16d样品中，蓝细菌门超过变形菌门(12.63%)成为新的第二优势菌群，相对丰度到达32.43%。杜瑞等[18]研究发现厚壁菌门和变形菌门是发酵肉制品的优势菌门。黄郑朝等[19]研究发现厚壁菌门、蓝藻菌门(Cyanophyta)和变形菌门是发酵香肠中的优势菌门。邓祥宜等[20]发现宣恩火腿发酵过程中细菌门水平上的微生物群落主要有：厚壁菌门、变形菌门等。王馨蕊等[21]在诺邓火腿加工过程中细菌群落的动态变化研究中发现：厚壁菌门、变形菌门等细菌为发酵过程中的优势菌群。以上研究结果均与湘派卤牛肉的研究结果类似。有研究[22-25]表明：厚壁杆菌门主要包括一些芽孢杆菌、乳酸菌和葡萄球菌等，其中包括影响食品货架期有害菌，且近年来发现厚壁菌门微生物是高蛋白食品中常见的优势腐败菌。因此，卤牛肉作为高蛋白的动物性食品，需防范厚壁菌门微生物的污染。
图3 各样品和组样品在门水平下的细菌群落结构Figure 3 Bacterial community structure of the samples and groups at phylum level
2.2.2 属水平下的细菌群落组成分析 图4(a)显示的是15个样品中除去未分类细菌菌群外，剩余相对丰度排名在前10的细菌群落结构分布情况；
图4(b)为15个样品除去未分类菌群外，剩余细菌菌群组间排名前10的细菌群落结构分布情况，在16 d的贮藏期内，优势菌种呈不断变化的趋势。在LNR0d的3个样品中，除了LNR0d1的优势菌种为肠杆菌属(Enterobacter)以外，优势菌属为芽孢杆菌属(Bacillus)。在LNR4d的3个样品中，除去LNR4d2的优势菌属为芽孢杆菌属外，其余两个样品的优势菌属为巨大球菌属(Macrococcus)。在LNR8d的3个样品中，除去LNR8d3的优势菌属为肠杆菌属外，其余两个样品的优势菌属为魏斯氏菌属(Weissella)。在LNR12d的3个样品中，除去LNR12d3的优势菌属为肠杆菌属外，其余两个样品的优势菌属为芽孢杆菌属。在LNR16d的3个样品中，unidentified_Chloroplast为优势菌属。由图4(b)可知，在样品LNR0d、LNR12d中，优势菌种为芽孢杆菌属，相对丰度为28.36%，25.96%，且随着贮藏时间的延长，芽孢杆菌属呈动态变化趋势，在样品LNR4d、LNR8d、LNR16d中的相对丰度分别为29.10%，18.24%，14.19%，可能与其生物学特性有关。相关研究[26]也证实了芽孢杆菌属中部分菌种为兼性厌氧菌，在真空包装条件下可良好生长，芽孢杆菌的这一生物学特性可以很好地解释为何其能成为贮藏期间的优势菌属。肠杆菌属作为优势菌属之一，相对丰度为19.39%，15.56%，肠杆菌属同样也是样品LNR8d的优势菌属，相对丰度为19.50%。肠杆菌属兼性厌氧，广泛分布于自然界，普遍存在于人和动物中，卤牛肉样品中含有肠杆菌属，其原因可能是在卤制品卤制好后的摊凉过程中，被空气中的肠杆菌污染，因此，在卤制品的冷却过程中应该特别注意肠杆菌的污染。此外，魏斯氏菌属(18.55%)、芽孢杆菌属(18.24%)、巨大球菌属(8.79%)也同样是湘派卤牛肉贮藏过程中的优势菌属。样品LNR4d中，优势菌种为巨大球菌属，相对丰度为30.62%。且在样品LNR4d中，芽孢杆菌属的相对丰度仅次于巨大球菌属。在样品LNR16d中，优势菌种虽为unidentified_Chloroplast(32.41%)但其芽孢杆菌属(14.19%)、巨大球菌属(10.38%)的相对丰度>10%。其中芽孢杆菌属、巨大球菌属、魏斯氏菌属均属于厚壁菌门，而肠杆菌属则属于变形菌门。有研究[27]表明：芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠杆菌属为肉类中的优势腐败微生物。在属水平上，随着贮藏时间的延长，优势菌群呈动态变化趋势。
图4 各样品和组样品在属水平下的细菌群落结构Figure 4 Bacterial community structure at the genus level for each sample and group
2.2.3 主成分分析 由图5可知，累计方差贡献率为75.02%，其中PC1的贡献率为47.08%，PC2的贡献率为27.94%。在所有样品中，LNR4d、LNR12d、LNR16d组内样品之间距离较小，表明其组内细菌群落结构差异较小，且LNR16d组内细菌群落结构相似度较LNR4d和LNR12d而言高；
而LNR0d和LNR8d组内样品之间距离较大，表明其组内细菌群落结构差异较大。这可能是由于菌群在样品中分布不均导致的。总体来看，LNR0d和LNR8d样品分布于第一、四象限，LNR4d样品分布于第三、四象限，LNR12d样品分布于第一、三、四象限，LNR16d样品分布于第二象限。综上，15个样品之间的细菌结构差异较大。
图5 各样品主成分分析图Figure 5 Principal component analysis diagram of each sample
2.2.4 湘派卤牛肉的LEfSe分析 LEfSe分析(图6)表明，5组不同贮藏时间下的湘派卤牛肉共有17个差异指示种，其中，LNR4d有4个，LNR8d有1个，LNR12d有3个，LNR16d有9个，LNR0d一组缺失，表明此组中并无差异显著的物种。以LNR16d中差异指示种数量最多，丰度最高。其中，LNR4d～LNR16d样品中属水平下贡献最大的细菌菌群分别为巨大球菌属、微小杆菌属(Exiguobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)。相关研究[19]表明：巨大球菌属中的溶酪大球菌作为内源发酵剂可提高对脂肪和蛋白质的分解作用，可耐受一定浓度的食盐。其可在卤牛肉中生长繁殖，因对生物体无致病作用[28]，故其存在于卤牛肉中并不会对卤牛肉的安全性造成影响。乳杆菌属中的发酵乳杆菌有抑菌的功能特性[29-31]，这可能也是贮藏后期微生物丰度降低的原因之一。
图6 LDA值分布柱状图和进化分支图Figure 6 Histogram of LDA value distribution and evolutionary branching diagram
采用高通量测序的方法对湘派卤牛肉4 ℃贮藏期间的细菌多样性进行分析可知：LNR8d中细菌多样性和丰度最高，LNR4d最低；
样品贮藏过程中，15个样品中的优势菌门为厚壁菌门、变形菌门和蓝细菌门，优势菌属如下：LNR0d的样品中优势菌属为芽孢杆菌属(28.36%)；
LNR4d的样品中优势菌属为巨大球菌属(30.62%)；
LNR8d的样品中优势菌属为肠杆菌属(19.50%)；
LNR12d的样品中优势菌为属芽孢杆菌属(25.96%)；
LNR16d的样品中优势菌属为unidentified_Chloroplast(32.41%)。整体而言，15个样品的组内样本之间距离较大，表明其菌群差异性较大；
由LEfSe分析可知：样品中属水平下贡献最大的细菌菌群分别为巨大球菌属、微小杆菌属、乳杆菌属，进化分析图表明细菌菌群结构与贮藏时间有关。综上，大致可以推断出引起冷藏过程中卤牛肉货架期的微生物为芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠杆菌属中的部分微生物。因此在卤牛肉的贮藏过程中，可通过抑制上述菌属的生长繁殖来延长卤牛肉的货架期，如在卤牛肉包装中充入CO2、N2等气体[31]，或者可加入针对性的抑菌剂如ε-聚赖氨酸盐酸盐、乳酸链球菌素(Nisin)等[32]，从而达到抑菌的效果。由试验结果可知：芽孢菌属由于其耐高温的特性使其在贮藏0 d时属于优势菌属，因此，可根据芽孢杆菌的生理特性适当调整卤制工艺，从而起到抑制其初始菌的效果，其次还可根据芽孢萌发特性[33]调整其后期贮藏条件。脉冲卤制对于其他菌群有较好的抑制效果，后期优势菌群的改变可能是在样品卤制后的冷却过程中被环境中的微生物所影响，因此在冷却过程中要特别注意冷却环境中的微生物含量，可在冷却前事先对冷却环境采取一定的灭菌措施，如紫外杀菌等。