冉李燕，施徐森，朱培英，李文贵
云南农业大学动物医学院，昆明 650201
戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）感染可引起戊型肝炎。大多数戊型肝炎病例为急性感染，一般预后良好。HEV 感染也可发展成重症肝炎、暴发性肝衰竭或者慢性感染，主要通过粪-口途径传播，孕妇的发病率较高；
它也能以膜相关的准包膜形式（eHEV）在血液中循环[1]。戊型肝炎病毒科，分为正戊肝病毒属（Orthohepevirus）和鱼戊肝病毒属（Piscihepevirus）。正戊肝病毒属包含了A、B、C 和D 4 种（Orthohepevirus A to D）[2-3]，A 种在HEV 中所占比例最高，分为7 种基因型[4]。A 种基因I 型和基因II 型的自然宿主只有人，基因I 型毒株在世界范围内广泛流行，分为6 个基因亚型（1a-1f），主要分布在亚洲、非洲和墨西哥等一些发展中国家，代表毒株为缅甸株。基因II 型有2 个基因亚型，分别为2a 和2b，其代表株为墨西哥株。目前未发现有关其他区域中基因II 型的相关报道。基因III 型和基因Ⅳ型均为人畜共患型，基因III 型分为10 种基因亚型，同源性在78.74%～82.46%[5]，主要分布在美国及欧洲等其他发达国家，基因III 型除了能感染人以外还能感染家猪、野猪、兔子、老鼠、鹿、猫鼬等动物。兔源HEV 基因和其他基因III 型不同是由于基因组中有大量基因变异和插入片段[6]。Ⅳ型HEV 主要分布在亚洲国家，包括中国、泰国及日本等国家，与其他毒株的同源性为71.79%～77.38%，能从人、猪、野猪、牦牛、牛、绵羊和山羊中分离到。基因V 型和基因VI 型只能从野猪中分离，两者同源性超过78%[7]，到目前为止，还没有与这些基因型相关的人类感染。
哺乳动物和鱼HEV 的基因组全长均为7.2 kb，禽HEV 的基因组大小为6.6 kb[8]。由3 个互相重叠的开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）构成（图1）。ORF1编码含有1 693 个氨基酸的蛋白质，主要编码与戊肝病毒RNA 复制相关的甲基转移酶、RNA解旋酶、蛋白酶和RNA 聚合酶等几个比较保守区域的非结构蛋白[9]；
ORF2始于ORF1的3’端，编码含有660 个氨基酸的衣壳蛋白，有重要的中和表位，可与受体结合，因而其功能与HEV 跨物种传播、病毒与靶细胞的相互作用和免疫原性有关[10-12]；
ORF3编码产物为磷酸化蛋白与细胞骨架结合的蛋白，分子量大约14 kD，具有HEV 病毒重要的结构蛋白基因，其N 端含有2 个疏水结构域16-32 aa 和37-62 aa，ORF3通过第一疏水区与细胞骨架结合。
图1 HEV 基因组结构[13]
HEVORF3位于病毒基因组3’端，是一个小的磷蛋白，它与ORF2和ORF1基因段有部分重叠。ORF3蛋白在亚细胞部分可能参与细胞骨架的形成，与细胞骨架的形成具有密切的联系。
研究表明，HEV ORF3 的核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均显著高于ORF1和ORF2的同源性，且更易发生突变[14]。Laura 等首次描述了从基因型IV 人类HEV（TW6196E 株）的克隆cDNA 中成功地在体外和体内挽救感染性HEV，证明基因型IV HEV 感染性克隆的实用性，为将来阐明HEV 跨物种感染的分子机制提供了方向；
进行序列分析后显示基因型ⅣHEV（TW6196E）与基因型ⅠHEV 株、基因型Ⅱ墨西哥株、基因型Ⅲ株和基因型Ⅳ株的核苷酸序列同源性分别为74%、73%、75%和94%[15]。
HEV ORF3 编码的氨基酸中存在免疫应答区。有学者通过人工合成肽方法发现，在ORF3蛋白的91-119 位之间的氨基酸包含一个免疫应答区。有人用同样的方法合成了墨西哥毒株和缅甸毒株的相同长度但不同位置的ORF3片段，经过结构分析后从每株筛选出2 个包含抗原位点最多的肽段，用这4 段抗原多肽与阳性血清做酶联免疫吸附试验。试验结果确切证明了墨西哥株ORF3蛋白最强的免疫反应区分布于C 端的第112-123 氨基酸之间，而缅甸株的最强免疫反应区位于C 端112-117 氨基酸之间，这两株病毒之间呈现出较大差异，这也进一步印证了ORF3蛋白与HEV 病毒株型特异性相关。
有研究表明，HEV ORF3 蛋白也至少含有4 个抗原表位，在细胞信号转导中扮演重要角色[16]。在ORF3第80 位丝氨酸上存在1 个磷酸化修饰位点，而磷酸化的ORF3蛋白可以与活化及调节蛋白激酶细胞信号途径上的通路蛋白结合，包括蛋白激酶Fyn、Hck、Src 等，从而参与细胞信号的转导和细胞的有丝分裂。而ORF3蛋白的75-88 位氨基酸和104-113 位氨基酸，存在2 个脯氨酸区域，其中1 个可以和SH3 结构域结合，该结构域是Fyn、Hck、Src等蛋白激酶的共有部分，是各种细胞内信号转导蛋白与活化细胞表面之间连接的桥梁。位于ORF3C端的脯氨酸-丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸（PSAP）晚期结构域基序与一种ESCRT-I 蛋白即细胞TSG101（肿瘤易感基因-101）特异性相互作用，细胞TSG101 随后招募ESCRT-II 和ESCRT-III 复合物，从而促进HEV 衣壳向多泡体（MVB）出芽。
其次，HEV ORF3 与病毒颗粒的装配与释放有关。HEV ORF3 蛋白完全暴露于细胞质中的膜拓扑结构，这对了解其在病毒生命周期中的相互作用提供了方向[17]；
HEV ORF3 还可以作为病毒孔蛋白，释放感染性因子[18]；
ORF3蛋白磷酸化促进其与ORF2的相互作用，从而影响识别、释放病毒颗粒[19]。
HEV ORF3 可以通过抑制各种PRRs（模式识别受体）介导的NF-κB 信号通路，减弱LPS（脂多糖）诱导的细胞因子产生和趋化因子形成[20]。这些抗炎特性对于阐明巨噬细胞在慢性HEV 感染和肝硬化中的作用和机制具有重要意义。戊型肝炎病毒感染宿主细胞之后先表达ORF3蛋白，激活MAPKERK 通路，使宿主细胞始终处于增殖、分化状态，而在病毒感染的后期才表达ORF2蛋白[21-22]。
HEV ORF3 蛋白具有免疫抑制的作用，而且ORF3的磷酸化影响其生物学功能。HEV ORF3 蛋白用一系列方式，抑制促炎因子和干扰素的表达。HEV ORF3 可降低IL-1b、COX-2、ICAM-1 和IFNα 的mRNA 和蛋白质表达水平，从而促进先天性免疫反应[23]。HEV ORF3 还能显著抑制LPS 诱导的炎性细胞因子（TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-8、IL-12p40 和IL-18）的产生，而这些炎症细胞因子和趋化因子在HEV 病毒感染期间发挥重要作用[20]。HEV ORF3 蛋白也能保护细胞免受线粒体去极化和死亡，研究表明N 端缺失的人α1 微球蛋白/bikunin 前提蛋白（AMBP） 可以与ORF3蛋白发生特异性结合[24]。ORF3蛋白存在时能够促进α1 蛋白对免疫系统的抑制作用，进而有利于戊肝病毒在肝细胞中的存活。Bikunin 是与ORF3蛋白强烈作用的配体，与ORF3蛋白的作用区域位于ORF3蛋白的C 端，该区域与ORF3蛋白二聚体形成位点和ORF3蛋白与SH3 的结合位点重叠，ORF3蛋白与bikunin 的结合抑制了bikunin 对肿瘤细胞扩散的阻碍作用。
此外，ORF3蛋白也被证实可以通过减弱急性炎性反应来抑制宿主固有免疫，并可以增加免疫抑制因子如alpha-1-微球蛋白的分泌，抑制促炎细胞因子的表达[25-26]。HEV ORF3 蛋白还可以使干扰素信号通路的信号因子STAT1 的磷酸化不发生表达，而下调INF-α 的表达，以逃避免疫应答，从而引起细胞中病毒的持续存在[27]。Huang 等[28]证明HEV 基因型IV 的ORF3诱导信号调节蛋白α 表达，该蛋白可阻断IRF3（干扰素调节因子3，Interferon regulatory Factor 3）的磷酸化并抑制干扰素的诱导。
HEV ORF3 是宿主细胞释放感染性病毒粒子所需的功能性离子通道。有研究表明，HEV 的ORF3与Ⅰ类病毒孔蛋白共用某关键结构的离子通道，而这在感染期间对病毒粒子释放出细胞至关重要[29]。HEV ORF3 还通过影响整体膜蛋白和基底膜蛋白的表达来改变宿主细胞免疫过程，在病毒与细胞相互作用中发挥功能作用，影响宿主细胞凋亡和脂质代谢[30]。有研究团队通过RT-PCR、实时荧光定量PCR 及蛋白印迹等技术发现了Ⅲ型HEV ORF3 通过调节TLR3（Toll-like receptor 3，Toll 样受体3）和TRIF（Toll-interleukin 1 receptor homology-domaincontaining adapter-inducing interferon-8，β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白）的转录水平，从而促进病毒作用机体[31]。同时，HEV ORF3 可通过下调TLR3 和TLR7（Toll-like receptor 7，Toll 样受体7）及相关的下游活性因子抑制宿主细胞I 型内源性干扰素的生成[32]。因此对ORF3 的研究有助于进一步了解与防控戊肝病毒。
HEV 的ORF3 能够显著损伤巨噬细胞的吞噬作用，这就解释了HEV 导致衰竭患者巨噬细胞的吞噬能力明显弱于非HEV 导致的肝衰竭的临床研究结果。研究表明HEV ORF3 可通过下调CD14（CD14 是巨噬细胞表面最常见的吞噬细胞受体之一）和CD64（Fcγ 受体（FcγR）家族的一员）的表达，显著损害巨噬细胞的吞噬功能，这可能是通过抑制Janus 激酶信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）途径信号通路的激活引起的，这为HEV 慢性感染提供了新的可能机制和治疗靶点[33]。
HEV ORF3 抗原表位多于ORF2，在HE 的诊断过程中具有重要意义。毕胜利等[32]曾利用大肠杆菌表达了ORF2、ORF3及ORF2和ORF3的嵌合蛋白，并将这3 种蛋白分别作为抗原与健康人血清做了间接ELISA 免疫试验，结果显示嵌合抗原与标准试剂盒的阳性符合率最高，利于结果判断，而ORF3抗原的阳性符合率高于ORF2抗原，这说明ORF3基因编码的蛋白含有较多的抗体结合位点。此外，王敏[34]成功筛选和制备了抗基因Ⅰ型HEVORF3蛋白的单抗，并成功偶联辣根过氧化物酶（HRP），利用HRP 标记单抗建立了检测人血清中HEV 抗体的竞争ELISA 方法。可见ORF3抗原蛋白对于HEV 的免疫诊断极有价值，对HEV 疫苗和诊断试剂盒研发具有重要价值。
戊型肝炎严重危害人类健康，对戊型肝炎的预防，除切断传播途径外，应用疫苗是根本手段。HEV ORF3 是疫苗研制的一个重要方向。目前研究主要有DNA 疫苗，近年来己经有HEV ORF2 和ORF3 蛋白在不同宿主内成功表达的例子，如Maurer 等[35]在小鼠肌肉组织中施用一种新型合成的肌性腺相关病毒载体 （AAVMYO3）来表达HEV ORF3，从而开发针对HEV 和其他传染性病原体的基于载体的疫苗，以补充传统疫苗。研究表明，使用HEV-4 ORF3 蛋白与白细胞介素-1β 融合的重组疫苗可能对病毒的攻击具有部分保护作用[36]。
还有研究表明，HEV ORF3 蛋白（包括禽HEV ORF3）免疫原性很高，可引起宿主体液反应，大多数B 细胞表位位于HEV ORF3 的C 末端，这可能是研制亚单位重组疫苗的一个方向[31-37]。Yang 等[37]研究发现使用免疫原性ORF3 表位作为HEV 亚单位疫苗的附加成分之前，似乎需要对不同HEV 基因型的HEV ORF3 蛋白的抗原表位进行系统的定位，才能更好地发挥其作用。此外，其他新型疫苗如基因型IV 衍生肽疫苗也在处于不同的开发阶段[38-40]。
世界各地区流行的HEV 病毒株在ORF3区虽然存在较大差异，但总体上具有很大程度的同源性。HEV 的ORF3 这种特性为将来的研究开发HEV疫苗和诊断试剂提供了可能。在戊型肝炎疫苗的研发过程中，也可以按照ORF3基因区的差异区分HEV 各流行株的差异，研发以ORF2抗原为主同时加入某一流行株的ORF3抗原的单价疫苗，或在ORF2抗原中加入多种流行株的ORF3的多价疫苗，能够使疫苗和诊断试剂的效果更加准确、有效，这可能成为未来疫苗研究的方向。
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