【摘要】目的 观察盐酸氨溴索（AMB）对铜绿假单胞菌（P.a）的生物被摸（BF）破坏清除作用及其与左氧氟沙星（LFX）联合后对BF内P.a的影响。方法 分别建立PAO1的3 d和7 d体外BF模型，随机（随机数字法）分为空白对照组、AMB组，AMB+LFX组。AMB质量浓度分别为256 μg/ml和512 μg/ml。于体外早期和成熟BF模型形成后，分别加入不同质量浓度的AMB，作用24 h后，连续稀释法行载体表面BF内P.a活菌计数，SEM观察载体表面BF形态学变化； 采用单因素方差分析法（One-Way ANOVA）进行计量资料的统计分析。结果 无论是早期BF还是成熟期BF，药物作用24 h后SEM观察，AMB组载体表面BF较空白对照组明显减少，并且随着AMB质量浓度的增加，载体表面BF呈减少趋势。无论是早期BF还是成熟期BF，1 μg/ml的 LFX组可以减少BF内细菌（P[1]。P.a有多种生存策略，最主要的是能形成生物被膜（biofilm，BF）。Zhao和Liu[2]报道化痰药N-乙酰半胱氨酸可以抑制细菌在物体表面的黏附，减少和预防形成BF，显示出BF抑制剂的特性。盐酸氨溴索（ambroxol， AMB）是临床广泛应用于各科的药物之一，有溶解粘蛋白、抗炎和抗氧化作用[3]，其作用机制和N-乙酰半胱氨酸有相似之处。但是，对BF的作用，目前还不完全清楚。本研究针对这一问题进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
载体为医用输液管（截为10 mm，备用）。实验菌株为P.a野生株PAO1（由丹麦哥本哈根大学临床微生物研究室提供）；ATCC 27853（广西医科大学第一附属医院微生物室提供）。培养基及药物：LB（Luria-Bertani）（Sigma公司）；盐酸氨溴索（批号：100599-200502，中国药品生物制品检验所）；左氧氟沙星（LFX，批号：130537-200301，中国药品生物制品检验所）。仪器：恒温摇晃培养箱（中国科学院武汉科学仪器厂）；SPX型智能生化培养箱（宁波江南仪器厂）；台式低温高速离心机（5410R，德国Eppendof）；超声震荡清洗机[B-2500 S-MTH 必能信超声（上海）有限公司]；扫描电镜（S-800日本）。
1.2 方法
1.2.1 药物对PAO1最低抑菌浓度（MIC）的测定 试管二倍稀释法测定LFX和AMB对实验菌株PAO1野生株的MIC，同时平行测定其对质控菌株ATCC 27853的MIC作质量控制。敏感性分类和质量控制均采用美国临床检验标准委员会推荐标准。
1.2.2 生物被膜体外模型的制备 细菌BF的制备：按文献[4]方法，采用输液管为载体进行BF 的培养。取隔夜培养的含有PAO 1 的肉汤， 比浊仪调定为0.5麦氏单位， 吸取0.1 ml菌液种入到含有4.9 ml LB液及10 mm输液管载体的24孔板中， 37 ℃培养， 隔日更换LB液，培养3 d得到早期BF，培养7 d 得到成熟BF。
1.2.3 扫描电镜标本的处理与观察 将输液管在2.5%戊二醛中固定，PBS中漂洗，梯度乙醇脱水，真空喷镀金粉。观察与摄片条件： 电压20 kV ，放大倍数：3750。
1.2.4 P.a 的BF内存活菌菌落计数 取出输液管载体，10 ml生理盐水冲洗载体表面的浮游菌，然后放入加有2 ml无菌生理盐水的小试管中，超声震荡10 min脱膜，涡旋1 min使菌液充分混匀。连续稀释法进行载体表面活菌计数计算细菌浓度，然后换算输液管细菌计数的常用对数。结果用均数±标准差（x±s）表示，每次测定均重复测3 次计算平均值。
1.2.5 AMB和LFX联合用药方法 分别设置空白对照组、LFX组、以及LFX+AMB组，每组6份载体。LFX终质量浓度为1 μg/ml，AMB终质量浓度分别为256 μg/ml、512 μg/ml。空白对照组使用无菌生理盐水。将上述各组药物加入24孔培养板中，每孔液体为2 ml。将附有早期或者成熟BF的输液管经无菌生理盐水充分漂洗后放入各孔中，37 ℃孵育24 h。
1.3 统计学方法
采用SPSS for windows 13.0 统计软件进行分析处理。采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P0.05）；当LFX联合的AMB质量浓度增加至512 μg/ml时，则BF内活菌计数明显降低（P[5]。细菌BF中，胞外多糖纤维或多糖-蛋白质复合体纠缠在一起并交错成立体网状，间隙内充满了带有负电荷的藻酸盐，形成黏稠致密的黏液样物质，它们构成细菌生长的外环境，形成坚固的弥散屏障，阻碍了抗生素的渗透和弥散[5]。在这种状态下，抗菌药物只能杀灭表层细菌，而无法以有效浓度渗透至深部细菌之中，成为慢性感染的重要原因。 有研究发现14、15元环大环内酯类[6]抗生素和磷霉素[7]等可以破坏已经形成的BF，并与其他抗生素对BF内细菌有协同杀菌作用；中草药金银花、黄芩对BF的破坏作用等[4，8]也逐渐引起人们的关注。
本研究发现，早期或者成熟BF，经512 μg/ml AMB作用24 h以后，载体表面BF均有不同程度的减少，部分被清除破坏，以早期BF的变化明显。说明一定质量浓度的AMB可破坏BF的形态结构，使其变得稀疏，从而增加抗生素的渗透，增加BF内P.a接触到的抗生素量。随后笔者进行的AMB和LFX的联合实验表明，BF经LFX与不同质量浓度AMB联合作用后，载体BF内P.a均较LFX单独使用时减少（Pst century： pharmacological and clinical update[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol， 2008，4（8）：1119-1129.
[4] 孔晋亮，陈一强，闫萍，等. 黄芩水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜清除作用的体外研究[J]. 中华结核和呼吸杂志， 2006，29（5）：347-348.
[5] Rybtke MT， Jensen P?，H?iby N， et al. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections[J]. Inflamm Allergy Drug Targets，2011， 10（2）：141-157.
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[8] 陈一强，覃雪军，朱莲娜，等. 金银花水煎液及联合头孢他啶对铜绿假单胞菌生物膜的体外影响[J]. 中华微生物学和免疫学杂志， 2004，24（9）：738-742.
（收稿日期：2012-04-27）
（本文编辑：邵菊芳）
DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2012.11.011
基金项目：国家自然科学基金（30760084）；广西壮族自治区卫生厅基金课题（Z2010334）；广西壮族自治区中医药管理局基金课题（gzzc1138）；广西壮族自治区教育厅课题（桂教201106LX092）；本研究获得广西大型仪器网测试补助
作者单位：530021 南宁，广西医科大学第一附属医院呼吸内科（张东伟现工作于广西柳州市人民医院呼吸内科）
通信作者：陈一强，Email：kjl071@163.com
中华急诊医学杂志2012年11月第21卷第11期Chin J Emerg Med，November 2012，Vol.21，No.11
P1230-P1233