王亚秀,张妮南,张学芬,和禹廷,刘小愿,张鲁刚
(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)
花青素不仅可以赋予蔬菜、水果五彩斑斓的颜色，而且还具有丰富的营养价值，同时花青素作为天然的抗氧化剂，也是最强效的自由基清除剂[1]，更有利于预防疾病等功能[2-4]。相较于普通大白菜，紫色大白菜积累了较多的花青素，能够在不同的生长环境和生长阶段表现出不同程度的紫色[5]。在研究中发现，植物组织中是否含有花青素，通常通过肉眼观察和花青素的测定两种途径，肉眼观察不仅判断准确性差，而且观察者也存在差异。花青素的测定方法虽然结果准确，但需要专门仪器，如pH示差法，分光光度计[6]，高效液相色谱串联质谱仪等方法[7-9]，操作过程复杂，测定成本高，不适宜大量样品的快速判断。因此，寻找一种快速检测植物组织花青素、辅助提高肉眼观察准确性的鉴定技术十分必要。
对于不同程度紫色大白菜，人眼观察到的颜色容易受到个体差异和环境因素的影响，色差计可以客观地定量颜色，并且可以量化评估颜色[10-11]。近年来，色差计在蔬菜和水果品质上评定应用研究日益广泛[12]，利用色差计可以快速检测西瓜、番茄红素含量[13]；
测定成熟黄瓜果皮色差值，并根据色差值将黄瓜成熟果皮可分为不同色系[14]；
在观赏辣椒类胡萝卜素积累特性的研究中，发现色差值a*与类胡萝卜素具有较高的相关性[15]；
有研究报道以色差值L、a、b、c、h和 DA值对冬枣色泽进行判定，发现色泽与甜度存在相关性，说明用色差预测冬枣的甜度是可行的[16]。本研究利用色差计对散叶紫色叶脉大白菜的叶脉颜色判定分析，进一步探讨色差计在大白菜叶脉花青素含量判断中的可行性。
1.1 试验材料
供试的散叶大白菜由西北农林科技大学园艺学院白菜研究课题组提供，种植于西北农林科技大学试验田。3类材料是经两代自交的纯合系，在莲座期叶脉表现出明显紫色、浅紫色和白色表型，群体内单株间性状表现高度一致。2020-09-01将所有试验材料播种在72孔穴盘，30 d后移栽到露地，35 d后进行叶脉颜色调查，根据叶脉颜色表型，将散叶大白菜叶脉颜色划分为紫色(图1-A)、浅紫色(图1-B)和白色(图1-C)，分别用Z、Q和B 表示。
A.紫色叶脉；
B.浅紫色叶脉；
C.白色叶脉；
标尺为 5 cm
1.2 花青素含量测定
移栽到露地35 d后，每个株系选取3个单株，取莲座期从外往里数第5、6、7片叶脉，距离叶脉底部5 cm处，用刀片切取叶脉上部新鲜样品将其混匀，取1 g测量花青素含量，将样品真空冷冻干燥，研磨至均匀的粉末，加入10 mL 1%盐酸-甲醇溶液，4 ℃低温避光浸提12 h, 离心后取上清液1 mL，加入pH 4.5的0.2 mol·L-1醋酸钠缓冲液4 mL，再取上清液1 mL加入pH 1.0 的0.2 mol·L-1氯化钾缓冲液4 mL，摇匀混合，分别以525 nm和700 nm 为吸收波长测定其吸光度。每个处理重复3次[17]。
提取液花青素浓度(mg·L-1) = A×εL-1×103×MW×稀释倍数
式中：A = ( A525 nm，pH1.0 -A700 nm，pH1.0 )-( A520 nm，pH4.5 - A700 nm，pH4.5) ；
ε为花青苷的摩尔消光系数，26 900；
MW为花青苷的摩尔质量(449.2)。
1.3 叶脉色差值测定
用CR-400色差计(北京光学仪器厂) 测定散叶大白菜中不同颜色叶脉的L*、a*、b*值。其中L*代表亮度轴，表示黑白，0为黑，100为白；
a*代表红绿轴，正值为红，负值为绿，0为中性；
b*代表黄蓝轴，正值为黄，负值为蓝，0为中性。移栽到露地35 d后，每个株系选取3个单株，取莲座期从外往里数第5、6、7片叶脉，距离叶脉底部5 cm处测定色差值并取平均值，每种颜色分别选择6个株系进行测量。
2.1 不同颜色叶脉的花青素含量比较
采用pH示差法对单位质量不同颜色叶脉花青素含量进行测定，结果如图2-A所示，紫色叶脉中花青素含量最高，达78.45 mg·kg-1，浅紫色叶脉中含有较高的花青素，含量为16.70 mg·kg-1，而白色叶脉中的花青素含量最低，仅有1.99 mg·kg-1。进一步对不同颜色叶脉花青素提取上清液颜色拍照比较，结果如图2-B所示，紫色叶脉的上清提取液颜色呈紫红色，浅紫色叶脉的上清提取液呈粉红色，白色叶脉的上清提取液颜色则呈黄绿色。总之，不同颜色叶脉花青素的总含量差异达到显著水平，花青素含量变化趋势与叶脉颜色由深至浅变化趋势基本一致，上清液颜色也与叶脉颜色由深至浅变化趋势基本一致，相比较浅紫色叶脉与白色叶脉花青素含量差异较小，其花青素提取液颜色也比较接近。
A.花青素含量；
B.花青素提取液颜色。柱图上的不同字母表示差异显著(P<0.05)
2.2 不同颜色叶脉的色差值比较
根据叶脉颜色变化将试验材料划分为紫色叶脉(Z)、浅紫色叶脉(Q)和白色叶脉(B)。用色差计分别测量其叶脉色差值参数L*、a*和b*，结果表明(图3)，紫色叶脉(Z)的L*值分布在 47.21～ 53.62，浅紫色叶脉(Q)的L*值分布在 61.63～67.44，白色叶脉(B)L*值在70.62～ 75.31，说明从Z、Q到B叶脉亮度逐渐增加，即反映了从Z、Q到B叶脉的色素积累逐渐减少，反光增强，并且三者的L*值间隔明显，很容易相互区分。在红绿轴参数a*中，3类材料也表现出一定的色差规律，Z的参数a*为正值，说明Z的颜色偏向红色，而Q和B参数a*为负值，说明Q和B的颜色偏向绿色、且Q较B的参数a*值更小，Q和B的a*有明显间隔，也可以明确区分。黄蓝轴b*的表现与红绿轴参数a*正好相反，Z的b*值为负值，而Q、B的b*值为正值，说明Z比Q和B颜色趋近于蓝色，其中Q较B的参数b*小，Q和B的b*存在明显间隔，可以明确区分。由此可见，3个色差值变化规律与人眼观察到的颜色变化趋势基本一致，3种材料的色差值参数L*、a*和b*间均存在明显差异，但都是Z与Q和B的差异最大，而Q和B的差异较小，区别Q和B需要确定相应的界限值，方可作为一种可靠客观的表示叶脉颜色变化的方法。
柱图上的不同字母表示差异显著(P<0.05)
为了进一步明确区分紫色、浅紫色和白色叶脉颜色差异范围，对其色差值参数L*、a*和b*值做显著性差异分析，在0.01水平上分析了3个参数的范围(表1)。紫色、浅紫色叶脉和白色叶脉的L*值范围分别是49.473±2.427、64.530±2.184、72.723±1.652；
紫色、浅紫色叶脉和白色叶脉的a*值范围分别是11.847±2.396、-2.44±1.593、-6.705±1.611；
紫色、浅紫色叶脉和白色叶脉的b*值范围分别是-3.315±1.329、 8.765±1.239、13.752±2.445。其中紫色叶脉和浅紫色叶脉、浅紫色叶脉和白色叶脉的L*值边界的间隔分别是10.446和4.357，浅紫色叶脉和白色叶脉的a*值边界的间隔分别是1.061，浅紫色叶脉和白色叶脉的b*值边界的间隔分别是 1.303，可以看出3种材料的色差值参数L*、a*和b*边界间均存在明显间隔，其中L*值的间隔最大，最容易区分紫色、浅紫色叶脉和白色叶脉。以上述各个参数间隔的中点作为划分界，则利用3个参数进行紫色叶脉判断，其标准如下：色差参数L*值为Z≤52，62≤Q≤68，70≤B；
a*值为Z≥9，-3≤Q≤0，B≤-5；
b*值为Z≤0，6≤Q≤10，11≤B。因此，可以作为判断紫色、浅紫色和白色叶脉颜色差异的方法。
表1 不同颜色叶脉色差值平均值差异显著性分析及有效区间Table 1 Significant analysis of average values and effective interval of different color veins
2.3 色差值与花青素含量的相关性分析
对散叶大白菜不同颜色叶脉总花青素含量与色差值进行相关性分析，结果如表2所示。花青素含量与色差值L*、a*、b*存在极显著正相关，其相关系数分别为0.8917、0.7979、0.8917，所以色差值在一定程度上可以反应花青素含量。
表2 不同颜色叶脉色差值与花青素含量相关性Table 2 Correlation coefficients among chroma value and anthocyanin content of different color veins
前人研究表明富含花青素的蔬菜，不仅抗氧化能力强，对人的大脑、肝脏和肾脏可以产生有效的保护作用[18]，对预防心血管疾病、控制肥胖也有价值[19-20]，因此培育积累花青素的蔬菜成为品质育种的重要方向。通过多年的研究，蔬菜育种科学家已培育出富含花青素大白菜的多种类型[21-24]。本试验中使用的散叶大白菜是一种新的大白菜材料，其特点是叶脉表型为紫色，富含花青素，是上述紫色大白菜白色叶脉的一个补充，对紫色大白菜新种质创制可以提供新的可能，能够进一步满足人们对大白菜多样性的需求。
由于花青素合成的复杂性及环境条件的影响，普遍存在紫色深浅的判断情况[25]，紫色观赏辣椒，因其品种和生长环境不同，对花青素测量标准产生一定影响[26]，茄子果色作为茄子果实的重要商品性状，选育果皮富含花青素的品种对茄子育种具有一定意义，所以如何快速判断紫色果色程度显得尤为重要[27]。而色差计作为一种简单的颜色偏差测试仪器，通过输出L*、a*、b*3组数据，从3个方面评估测试材料的色泽变化，从而可以反应相应色素物质含量多少，可以减少因外界因素及人为因素造成的试验误差。色差计在番茄、辣椒和茄子等蔬菜上应用广泛，涉及果皮颜色、番茄红素含量、类胡萝卜素含量的测定[28]，但未见在大白菜紫色性状中的应用。
与其他紫色蔬菜研究类似，本试验使用的散叶大白菜在紫色叶脉判断过程中会受多种因素的影响导致肉眼判断误差。利用pH示差法，对叶脉花青素提取，不同颜色叶脉花青素提取液在经过12 h处理后出现不同深浅的颜色变化，这与叶脉花青素含量相关；
另外，相同颜色叶脉提取液也存在不同程度的颜色梯度，这一结果可能是以肉眼为判断标准所取的样品存在差异导致的；
值得关注的是Q、B花青素上清液颜色肉眼区分模糊，但花青素测定结果表明Q、B的花青素含量具有显著性差异，说明可视化结果虽然直观，但量化的结果更准确，这就要求在取样过程中更加精细和科学。进一步采用色差计对大白菜紫色叶脉、浅紫色叶脉和白色叶脉色差进行测定比较，结果3个材料3个色差参数的差异均达到显著水平、并且有不同的间隔，都可以区分3种不同颜色的叶脉，其中3个材料的L*值具有最大的间隔，最容易区分3个材料，相比较花青素测定方法，色差值测定只需要便携式色差仪，不需要专门试剂和复杂仪器，也没有样品前处理等过程，检测速度快，成本低，是一种简单、准确的量化紫色性状的方法，为大白菜紫色叶脉性状的基因定位、分子机理研究提供了新的方法，解决了采样过程中因人眼无法准确判断颜色而导致试验结果误差的问题，这与前人利用色差计测定番茄红素方法相似[13,29]，对于同类研究有一定的借鉴意义。